The invention discloses a LAMP detection method for E. coli from newborn piglets based on enterotoxin gene, that is, adopting ST2.
【技术实现步骤摘要】
一种基于肠毒素基因的新生仔猪源大肠杆菌LAMP检测方法
本专利技术涉及动物病原快速诊断
，特别是一种基于肠毒素基因的新生仔猪源大肠杆菌LAMP检测方法。
技术介绍
新生仔猪腹泻一直以来是危害养猪业的重要疾病，虽然引起仔猪腹泻的原因比较复杂，但致病性大肠杆菌是引起仔猪腹泻的重要病原菌。目前对大肠杆菌的检测方法主要有传统的分离鉴定、免疫血清学检测以及传统的PCR方法等，但这些方法检测步骤复杂、耗时长、灵敏度较低且对检测环境要求严格，不能满足基层现场快速准确检测的要求。环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是Notomi等发现的一种恒温核酸扩增技术，与传统的PCR技术相比，省去了PCR反应的变性、温度循环等一系列繁琐的过程，节省了反应时间，而且灵敏性比常规PCR高10倍以上。LAMP技术通过4条特异性引物对目的序列的6个区域退火杂交，利用BstDNA聚合酶的催化作用，在恒温条件下（60~65℃）温育30~60min，实现对目标序列的批量扩增。其反应结果可直接通过肉眼观察是否有白色焦磷酸镁沉淀产生进行...
【技术保护点】
1.一种基于肠毒素基因的新生仔猪源大肠杆菌LAMP检测方法，其特征在于，具体步骤如下： 1）采用ST2+肠毒素基因型大肠杆菌基因组DNA作为阳性对照，超纯水作为阴性对照，以样品基因组DNA为模板，进行LAMP扩增反应并获得扩增产物；LAMP反应体系：Mg2+浓度1～2 mM/L，甜菜碱0～1 mM/L，Bst DNA聚合酶192 U～384 U/mL, dNTP浓度0.4～2.4 mM/L，外引物F3和B3浓度均为0.2μM/L，内引物FIP和BIP的浓度均为0.8～2μM/L，DNA模板浓度在20pg～20ng/μL，以超纯水补足25μL；反应程序：扩增温度为60℃～63...
【技术特征摘要】
1.一种基于肠毒素基因的新生仔猪源大肠杆菌LAMP检测方法，其特征在于，具体步骤如下：1）采用ST2+肠毒素基因型大肠杆菌基因组DNA作为阳性对照，超纯水作为阴性对照，以样品基因组DNA为模板，进行LAMP扩增反应并获得扩增产物；LAMP反应体系：Mg2+浓度1～2mM/L，甜菜碱0～1mM/L，BstDNA聚合酶192U～384U/mL,dNTP浓度0.4～2.4mM/L，外引物F3和B3浓度均为0.2μM/L，内引物FIP和BIP的浓度均为0.8～2μM/L，DNA模板浓度在20pg～20ng/μL，以超纯水补足25μL；反应程序：扩增温度为60℃～63℃，反应45min；80℃灭活5min；所述引物F3、B3、FIP、BIP核苷酸序列依次如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示；向步骤1）扩增产物中加入1000×SYBRGreenI荧光染料，若出现绿色，则说明样品中含大肠杆菌；反之，则认为样品中不含大肠杆菌。2.根据权利要求1所述基于肠毒素基因的新生仔猪源大肠杆菌LAMP检测方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱善元，成大荣，封琦，蔡树东，
申请(专利权)人：江苏农牧科技职业学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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