一种循环肿瘤细胞的检测方法技术

本发明专利技术利用Apoptin蛋白在正常细胞和肿瘤细胞的定位特点，结合荧光物质的可视性，将Apoptin基因和荧光蛋白基因融合在一起，表达出带有荧光的Apoptin蛋白，并根据Apoptin蛋白在肿瘤细胞和正常细胞核内的定位特点，应用到循环肿瘤细胞的检测，并成功检测到循环肿瘤细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种循环肿瘤细胞的检测方法
本专利技术属于肿瘤学和医学检验领域，涉及到一种循环肿瘤细胞的检测方法，具体涉及一种通过凋亡素在正常细胞和肿瘤细胞的定位差异从人外周血中检测循环肿瘤细胞的方法。
技术介绍
循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcells,CTCs)是指由肿瘤原发灶释放进入外周循环系统中的肿瘤细胞，在癌症转移中具有关键作用。相对于外周血未检测到CTCs的患者来说，检测到CTCs的患者预后较差；相对于治疗后CTCs数升高的患者来说，治疗后CTCs数降低的患者预后明显改善。因此，CTCs检测在肿瘤患者的鉴别诊断、生存期预测、治疗效果监测等方面有一定的应用价值。目前，检测CTCs的方法主要有两类技术，一类是基于CTCs的物理性质，包括细胞大小、密度等来区分肿瘤细胞和正常细胞，二是基于特异性表面标记物将肿瘤细胞与外周血循环中的其它细胞分离。通过肿瘤细胞和正常细胞的物理特性来分离，缺乏特异性，存在较高的假阳性；通过特异性表面标记物来检测外周血中的循环肿瘤细胞，仅适用于具有独特表面标记物的CTCs，对于缺乏独特表面标志物的CTCs，无法检测，因此，开发一种特异性高，适应范围广的检测技术是十分必要的。凋亡素(Apoptin)是一种源自于鸡贫血病毒(chickenanemiavirus，CAV)的能够促进肿瘤细胞凋亡的小分子蛋白[i]。Apoptin由121个氨基酸构成，分子量为13.6Kd，其C端具有两条核定位序列(NLS)和一条出核序列(NES)。这些识别序列驱动Apoptin穿梭进入和离开细胞核。实验数据表明Apoptin在细胞内的定位由两条NLS和一条NES调节，NLS在正常细胞和肿瘤细胞中都具有活性，但NES仅在正常细胞内有活性，在肿瘤细胞内不存在活性，从而NES能将Apoptin定位在正常细胞的细胞质中，导致Apoptin在肿瘤细胞和正常细胞定位不同，Apoptin在肿瘤细胞主要定位在细胞核，而在正常细胞主要定位在细胞质。这一特性为检测循环肿瘤细胞提供了理论依据。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提出一种新的循环肿瘤细胞检测方法，该方法利用Apoptin在循环肿瘤细胞和外周血其他细胞的定位特点和荧光物质的可视性，将ApoptinDNA序列与荧光蛋白DNA序列融合后直接在细胞内表达，通过Apoptin的表达区域差异来鉴别循环肿瘤细胞和外周血其余单核细胞，该方法能有效的检测出血液中的循环肿瘤细胞，具有特异性高，适用范围广等优势。本专利技术的技术方案主要包括以下步骤：构建含有Apoptin和荧光蛋白基因的真核表达质粒；分离癌症患者的外周血单个核细胞；将含有Apoptin和荧光蛋白基因的真核表达质粒导入癌症患者的外周血单个核细胞，培养24-72小时；对细胞核进行染色，观察，识别循环肿瘤细胞。本专利技术的优选方案之一是通过重叠延伸PCR法，将Apoptin的108号位的苏氨酸突变成甘氨酸，构建pEGFP-N1-Apoptin-1T质粒，苏氨酸结构末端的羟基基团可以与磷酸基团结合，从而被磷酸化，而甘氨酸不能被磷酸化，因此用甘氨酸替代苏氨酸后，上述氨基酸位点将失去磷酸化能力，从而降低了Apoptin蛋白的活性，延长了肿瘤细胞凋亡的时间，获得足够长的时间来分辨循环肿瘤细胞。本专利技术的优选方案之一通过重叠延伸PCR法，将Apoptin的106-108号位的3个苏氨酸突变成甘氨酸，脯氨酸、甘氨酸，构建pEGFP-N1-Apoptin-3T质粒，苏氨酸结构末端的羟基基团可以与磷酸基团结合，从而被磷酸化，而甘氨酸、脯氨酸均不能被磷酸化，因此用甘氨酸、脯氨酸替代苏氨酸后，上述氨基酸位点将失去磷酸化能力，从而降低了Apoptin蛋白的活性，延长了肿瘤细胞凋亡的时间，获得足够长的时间来分辨循环肿瘤细胞。本专利技术采用的荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或者其他种类荧光蛋白，目的是进行荧光检测或分离定位。本专利技术采用的导入方法是电转或通过lipo2000转染试剂等方法。本专利技术利用Apoptin蛋白在正常细胞和肿瘤细胞的定位特点，结合荧光物质的可视性，将Apoptin基因和荧光蛋白基因融合在一起，表达出带有荧光的Apoptin蛋白，并根据Apoptin蛋白在肿瘤细胞和正常细胞核内的定位特点，应用到循环肿瘤细胞的检测，并成功检测到循环肿瘤细胞。该方法用血量为3ml，是已知检测方法(例如cellSearch系统需要7.5ml)用血量的一半，提高了效率，同时，该方法特异性好，克服了基于物理特性检测存在的特异性不高的问题,也克服了基于特异性表面标记物来检测外周血中的循环肿瘤细胞方法对某些肿瘤的限制(对于缺乏独特表面标志物的CTCs，无法检测)。该方法检测原理是基于Apoptin蛋白在细胞内的表达，只要是肿瘤细胞，都存在细胞质和细胞核之分，不受肿瘤细胞类型的限制，理论上，该方法可以检测任何类型的肿瘤细胞，具有适用范围广等优势。因此，本专利技术是一种特异性好，适用范围广，且效率高的循环肿瘤细胞检测方法，具有良好的应用前景。附图说明图1为Apoptin及Apoptin-EGFP促Saos-2凋亡结果示意图；图2为Apoptin及Apoptin-EGFP促H460凋亡结果示意图；图3-1为转染48h后Apoptin-EGFP在H460中的定位示意图；图3-2为转染48h后Apoptin-EGFP在Saos-2中的定位示意图；图3-3为转染48h后Apoptin-EGFP在MSC中的定位示意图；图4为Apoptin-EGFP-3T在不同来源的PBMC中的定位示意图；“+”:Apoptin-EGFP-3T定位在细胞核，判断为CTCs“-”:Apoptin-EGFP-3T定位在细胞质，判断为正常细胞实施例实施例一：构建质粒pEGFP-N1-Apoptin和pcDNA3.1(+)-ApoptinPCR扩增Apoptin基因片段酶切Apoptin基因片段和质粒pEGFP-N1、pcDNA3.1(+)连接Apoptin基因片段和质粒pEGFP-N1、pcDNA3.1(+)，连接产物转化感受态DH5α，用氨苄平板，37℃恒温箱培养过夜。挑选单个质粒，提取重组质粒，酶切，测序，筛选符合要求的pEGFP-N1-Apoptin和pcDNA3.1(+)-Apoptin。实施例二：构建突变体pEGFP-N1-Apoptin-1T和pEGFP-N1-Apoptin-3T通过重叠延伸PCR法设计PCR扩增引物，其中pEGFP-N1-Apoptin-1T将108号位的苏氨酸突变为甘氨酸，pEGFP-N1-Apoptin-3T将106-108号位的三位苏氨酸突变为甘氨酸、脯氨酸、甘氨酸。PCR扩增、酶切，连接，构建突变体质粒pEGFP-N1-Apoptin-1T和pEGFP-N1-Apoptin-3T。转化感受态DH5α，用含抗生素平板，37℃恒温箱培养过夜。挑选单个菌落，提取重组质粒，酶切，测序，筛选符合要求的pEGFP-N1-Apoptin-1T和pEGFP-N1-Apoptin-3T。实施例三Apoptin及Apoptin-EGFP对人骨肉瘤细胞Saos-2影响(图1)将质粒pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-Apoptin，pEGFP-N1，pEGF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：(1)构建含有Apoptin基因和荧光蛋白基因的真核表达质粒；(2)分离癌症患者的外周血单个核细胞；(3)将含有Apoptin和荧光蛋白基因的真核表达质粒导入癌症患者的外周血单个核细胞，培养24‑72小时；(4)对细胞核进行染色，观察，识别循环肿瘤细胞。

【技术特征摘要】
1.一种循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：(1)构建含有Apoptin基因和荧光蛋白基因的真核表达质粒；(2)分离癌症患者的外周血单个核细胞；(3)将含有Apoptin和荧光蛋白基因的真核表达质粒导入癌症患者的外周血单个核细胞，培养24-72小时；(4)对细胞核进行染色，观察，识别循环肿瘤细胞。2.如权利要求1所述的检测方...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜晶春，
申请(专利权)人：广州医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44