微藻有效降解壬基酚的实验方法技术

本发明专利技术公开了四种微藻有效降解壬基酚的实验方法，实验步骤如下：1)、四种无菌微藻的培育；2)、提取和测定叶绿素a；3)、设置四组壬基酚实验组；4)、微藻对壬基酚的降解效应中微藻吸光值与细胞密度、生物量的相关性实验；5)、微藻对水中壬基酚的去除效应以及微藻对壬基酚的胞外吸附和胞内吸收效应。本发明专利技术筛选出的4种海洋微藻对壬基酚具有吸收、吸附和降解作用。它们是球形棕囊藻，拟微绿球藻，杜氏盐藻和亚心型扁藻，四种微藻对壬基酚的去除率(包括吸附率、吸收率和降解率)范围为47.18％‑96.36％，降解率范围达43.43％‑90.94％，四种微藻中，亚心形扁藻对NP的去除效果和降解能力最为显著。

【技术实现步骤摘要】
微藻有效降解壬基酚的实验方法
本专利技术属于降解壬基酚实验领域，更具体地说，涉及一种微藻有效降解壬基酚的实验方法。
技术介绍
由于壬基酚对生态系统存在许多严重的潜在危害，所以对壬基酚的降解和去除成为了研究热点。壬基酚降解的方法主要包括物理法(如活性炭等)，Sasai等用HDTMA改性蒙脱土(经0.20mm的滤膜过滤)制成的有机蒙脱土吸附NP时发现，在10min以内1mg的有机蒙脱土就可以吸附约0.1mg的NP分子，其对NP分子吸附率几乎达到了100％，但采用该方法的缺点是会形成新的材料污染，吸附污染物的材料应如何处理仍是个问题。化学法(超声波化学氧化法等)利用200kHz的超声频率、强度为6W·cm-2的条件下，用超声波可以降解30μMNP时，在利用氧气作为载气，pH>3的条件下，耗时100min，可降解90％的NP。但这些方法存在成本高，方法复杂等缺点。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供了一种微藻有效降解壬基酚的实验方法，设计合理，筛选出的4种海洋微藻对壬基酚具有吸收、吸附和降解作用。它们是球形棕囊藻，拟微绿球藻，杜氏盐藻和亚心型扁藻，四种微藻对壬基酚的去除率(包括吸附率、吸收率和降解率)范围为47.18％-96.36％，降解率范围达43.43％-90.94％，四种微藻中，亚心形扁藻对NP的去除效果和降解能力最为显著。为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：微藻有效降解壬基酚的实验方法，其特征在于：实验步骤如下：1)、四种无菌微藻的培育；将处于对数生长期的微藻先接种于250mL锥形瓶中，培养基体积为100mL，藻细胞初始叶绿素a含量为0.08mg/L；锥形瓶在人工气候箱培养，光照强度为150μmol/m2·s，温度为23±2℃，光周期为12L：12D，每天定时摇瓶三次，并随机更换锥形瓶在培养箱的位置，以保证锥形瓶中微藻受光均匀；2)、提取和测定叶绿素a；无菌微藻每天固定时间取样5mL，3500g离心15min，弃上清液，加入5mL抽提液(丙酮：乙醇＝1:1配制)，震荡摇匀，4℃冰箱黑暗处理24h后，同转速离心15min，取上清液于645nm，663nm波长下测定吸光值，空白抽提液为对照，叶绿素a浓度计算公式如下：Chlorophylla(mg/L)＝12.7OD663-2.69OD645；3)、设置四组壬基酚实验组；每组壬基酚实验组包括有6个NP浓度处理组，相同浓度的处理组包含有四组锥形瓶，每组有3个重复；六个处理组中的浓度分别为0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L；4)、微藻对壬基酚的降解效应中微藻吸光值与细胞密度、生物量的相关性实验；选择处于对数生长期的四种微藻，用灭菌后的培养液将其设置一系列的藻细胞浓度梯度，然后用紫外分光光度计测定浓度梯度藻细胞的吸光值A680；藻细胞密度通过显微镜在血球计数板在下对藻细胞进行计数；藻细胞干重的测定，先取每个浓度梯度的微藻藻液20mL，用孔径为0.45μm的玻璃纤维膜过滤，后在鼓风恒温干燥箱，60℃下烘干至恒重并称量；5)、微藻对水中壬基酚的去除效应以及微藻对壬基酚的胞外吸附和胞内吸收效应；处理组壬基酚浓度设置为0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L，空白对照组设置为只添加壬基酚不加微藻；根据预实验的实验结果(预实验结果表明助溶剂甲醇的无效应浓度为不超过总体积的0.6％)，且为确保壬基酚能够均匀的分散溶解到培养基中，因此将助溶剂甲醇的浓度设置为0.4％；首先将处于对数生长期的四种微藻接种于250mL锥形瓶，接种密度测试为106cell/mL培养基体积设置为100mL，之后放到人工气候培养箱中进行培养，将光照强度设定为150μmol/m2·s，温度设置为23±2℃，光周期设定为12L:12D，每天在统一固定的时间摇瓶三次，还要随机的更换锥形瓶在培养箱中的位置，来确保锥形瓶中的微藻能够均匀的受到光照。作为一种优化的技术方案，步骤5)中，培养液中壬基酚的残留量测定：检测时间为0，24，48，72，96，120h；取5mL培养液样品注入0.2mL氯苯和丙酮(1：2)的混合物在10mL带圆锥底的螺旋盖玻璃管中；轻轻摇动后，在试管中形成乳白色混浊溶液(水/氯苯)；然后将样品在4500g下离心5min；使用50μL微型注射器取出沉降在锥形试管底部的分散相的细小提取相细颗粒；该提取过程重复三次，并将沉淀部分合并以用高效液相色谱(HPLC)进一步分析；微藻对壬基酚吸附量的测定：检测时间为在24，72，120h；测定步骤：将上述步骤所得到的藻细胞沉淀用5mL10％甲醇洗涤并振荡约60s；包含在水中的NP可以被认为是表面吸附的NP，然后如上所述提取水中NP的方法提取NP，并通过HPLC分析；微藻对壬基酚吸收量的测定：检测时间设定为24，72，120h；测定步骤为：将上述(2)部分处理后的藻细胞沉淀，先加入适量的无水Na2SO4，之后超声处理20min，再用3mL二氯甲烷-甲醇(1：2v/v)萃取三次(涡旋仪混匀)，并将样品放置在3500g下离心5分钟；将溶剂部分合并，用氮气吹干，并通过HPLC分析；将上述的提取的NP样品，氮气吹干后，加入流动相(乙腈-超纯水80:20v/v)，用GF/F滤膜过滤，定容；用涡旋仪混匀，上机测定；或置于4℃冰箱保存至上机测定，保存时间不超过一周；使用安捷伦1100系列HPLC分析NP浓度，色谱柱的型号是AXDB-C18RScolumn(4.6×250mm，5μm)；采用乙腈-超纯水80:20v/v的流动相；进样体积设置为50μL，进样速度设定为1mL/min；激发波长调整在230nm，发射波长是305nm；停留时间为18min；最低检出限是5μg/L；该方法回收率为90-94％之间。由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本专利技术筛选出的4种海洋微藻对壬基酚具有吸收、吸附和降解作用。它们是球形棕囊藻，拟微绿球藻，杜氏盐藻和亚心型扁藻，四种微藻对壬基酚的去除率(包括吸附率、吸收率和降解率)范围为47.18％-96.36％，降解率范围达43.43％-90.94％，四种微藻中，亚心形扁藻对NP的去除效果和降解能力最为显著。本专利技术的测定指标：1、细胞密度，采用血球计数板，利用光学显微镜计数；2、生物量，采用干重法，先取定量藻液，后经孔径为0.45μm的玻璃纤维膜(WhatmanGF/F)过滤，利用鼓风恒温干燥箱设置60℃来烘干至恒重并称重；3、OD值，采用紫外分光光度计检测，在680nm波长下检测藻液的吸光值；4、壬基酚标准曲线配制，称取2g壬基酚标准品再溶于甲醇中，配制的浓度为2g/L壬基酚储备液，后再用甲醇配制一系列的壬基酚浓度(0.03125，0.0625，0.125，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0mg/L)，以0.22μm的微孔滤膜过滤并收集5mL滤液到螺口玻璃管中，置于4℃冰箱保存。HPLC(FLD荧光检测器)分析测定NP浓度，得到壬基酚的标准曲线为：y＝0.0041x-0.0355，R2＝1；其中，x为峰面积，y为壬基酚浓度。具体实施方式实施例壬基酚暴露在四种微藻后，向四种微藻中加入0.4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.微藻有效降解壬基酚的实验方法，其特征在于：实验步骤如下：1)、四种无菌微藻的培育；将处于对数生长期的微藻先接种于250mL锥形瓶中，培养基体积为100mL，藻细胞初始叶绿素a含量为0.08mg/L；锥形瓶在人工气候箱培养，光照强度为150μmol/m2·s，温度为23±2℃，光周期为12L：12D，每天定时摇瓶三次，并随机更换锥形瓶在培养箱的位置，以保证锥形瓶中微藻受光均匀；2)、提取和测定叶绿素a；无菌微藻每天固定时间取样5mL，3500g离心15min，弃上清液，加入5mL抽提液(丙酮：乙醇＝1:1配制)，震荡摇匀，4℃冰箱黑暗处理24h后，同转速离心15min，取上清液于645nm，663nm波长下测定吸光值，空白抽提液为对照，叶绿素a浓度计算公式如下：Chlorophyll a(mg/L)＝12.7OD663‑2.69OD645；3)、设置四组壬基酚实验组；每组壬基酚实验组包括有6个NP浓度处理组，相同浓度的处理组包含有四组锥形瓶，每组3个重复；六个处理组中的浓度分别为0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L；4)、微藻对壬基酚的降解效应中微藻吸光值与细胞密度、生物量的相关性实验；选择处于对数生长期的四种微藻，用灭菌后的培养液将其设置一系列的藻细胞浓度梯度，然后用紫外分光光度计测定浓度梯度藻细胞的吸光值A680；藻细胞密度通过显微镜在血球计数板在下对藻细胞进行计数；藻细胞干重的测定，先取每个浓度梯度的微藻藻液20mL，用孔径为0.45μm的玻璃纤维膜过滤，后在鼓风恒温干燥箱，60℃下烘干至恒重并称量；5)、微藻对水中壬基酚的去除效应以及微藻对壬基酚的胞外吸附和胞内吸收效应；处理组壬基酚浓度设置为0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L，空白对照组设置为只添加壬基酚不加微藻；根据预实验的实验结果(预实验结果表明助溶剂甲醇的无效应浓度为不超过总体积的0.6％)，且为确保壬基酚能够均匀的分散溶解到培养基中，因此将助溶剂甲醇的浓度设置为0.4％；首先将处于对数生长期的四种微藻接种于250mL锥形瓶，接种密度测试为106cell/mL培养基体积设置为100mL，之后放到人工气候培养箱中进行培养，将光照强度设定为150μmol/m2·s，温度设置为23±2℃，光周期设定为12L:12D，每天在统一固定的时间摇瓶三次，还要随机的更换锥形瓶在培养箱中的位置，来确保锥形瓶中的微藻能够均匀的受到光照。...

【技术特征摘要】
1.微藻有效降解壬基酚的实验方法，其特征在于：实验步骤如下：1)、四种无菌微藻的培育；将处于对数生长期的微藻先接种于250mL锥形瓶中，培养基体积为100mL，藻细胞初始叶绿素a含量为0.08mg/L；锥形瓶在人工气候箱培养，光照强度为150μmol/m2·s，温度为23±2℃，光周期为12L：12D，每天定时摇瓶三次，并随机更换锥形瓶在培养箱的位置，以保证锥形瓶中微藻受光均匀；2)、提取和测定叶绿素a；无菌微藻每天固定时间取样5mL，3500g离心15min，弃上清液，加入5mL抽提液(丙酮：乙醇＝1:1配制)，震荡摇匀，4℃冰箱黑暗处理24h后，同转速离心15min，取上清液于645nm，663nm波长下测定吸光值，空白抽提液为对照，叶绿素a浓度计算公式如下：Chlorophylla(mg/L)＝12.7OD663-2.69OD645；3)、设置四组壬基酚实验组；每组壬基酚实验组包括有6个NP浓度处理组，相同浓度的处理组包含有四组锥形瓶，每组3个重复；六个处理组中的浓度分别为0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L；4)、微藻对壬基酚的降解效应中微藻吸光值与细胞密度、生物量的相关性实验；选择处于对数生长期的四种微藻，用灭菌后的培养液将其设置一系列的藻细胞浓度梯度，然后用紫外分光光度计测定浓度梯度藻细胞的吸光值A680；藻细胞密度通过显微镜在血球计数板在下对藻细胞进行计数；藻细胞干重的测定，先取每个浓度梯度的微藻藻液20mL，用孔径为0.45μm的玻璃纤维膜过滤，后在鼓风恒温干燥箱，60℃下烘干至恒重并称量；5)、微藻对水中壬基酚的去除效应以及微藻对壬基酚的胞外吸附和胞内吸收效应；处理组壬基酚浓度设置为0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L，空白对照组设置为只添加壬基酚不加微藻；根据预实验的实验结果(预实验结果表明助溶剂甲醇的无效应浓度为不超过总体积的0.6％)，且为确保壬基酚能够均匀的分散溶解到培养基中，因此将助溶剂甲醇的浓度设置为0.4％；首先将处于对数生长期的四种微藻接种于250mL锥形瓶，接种密度测试为...

【专利技术属性】
技术研发人员：段舜山，王璐畇，孙东，朱博，陈琪，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44