利用dI碱基进行基因克隆与点突变的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用dI碱基进行基因克隆与点突变的方法，利用dI修饰引物，扩增载体与目标基因，然后将载体与目标基因片段用内切核酸酶V或DNA糖苷酶AlkA进行消化处理，在dI碱基处断裂DNA链，使载体与目标基因的末端分别形成带单链DNA尾巴的结构，二者的单链DNA彼此配对形成带缺口的环状重组DNA分子，载体和目标基因之间的配对区长达10‑15个碱基，不再需要DNA连接酶对DNA进行连接缝合，极大地增加了一次克隆反应中可以同时的目标基因数量，非常适合于高通量基因克隆。

【技术实现步骤摘要】
利用dI碱基进行基因克隆与点突变的方法
本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种利用dI碱基进行基因克隆与点突变的方法。
技术介绍
传统基因克隆技术涉及目标基因片段与质粒载体的限制性核酸内切酶消化、连接酶连接环化目标基因与质粒这两步必不可少的操作。基因克隆技术的出现极大地促进了现代基因工程、蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术缺点主要有：1）恰当的限制性酶切位选择繁琐；2）限制性酶位点的兼容性差导致克隆通量低；3）限制性内切酶消化不彻底或DNA连接反应效率低都会产生大量的阴性克隆，而且单一限制性酶消化法克隆还会因载体自连接生成大量空载体阴性克隆，这两方面都会导致阳性克隆率极低。虽然利用碱性磷酸单酯酶除去线性化载体的5’磷酸基团，会大大提高阳性克隆百分比，但该操作异常繁琐，手法难于掌握，经常起不到应有作用。为了克服常规基因克隆方法的缺陷，开发了不依赖于连接酶的克隆方法。其基本原理是通过外切酶消化目标基因与线性化载体DNA片段，生成3’或5’单链DNA，目标基因与线性化载体的单链DNA彼此互补配对，形成带DNA缺口的环状重组质粒，转化大肠杆菌后带缺口重组质粒被修复成环状闭合质粒。然而这种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用dI碱基进行基因克隆的方法，其特征在于，包括步骤为：（1）利用含有dI碱基的引物扩增目标基因和质粒载体；（2）利用内切核酸酶V或DNA糖苷酶AlkA对步骤（1）得到的PCR扩增后的目标基因和质粒载体在dI碱基处切断DNA链，得到目标基因的单链DNA尾巴和质粒载体的单链DNA尾巴；（3）将步骤（2）得到的目标基因的单链DNA尾巴和质粒载体的单链DNA尾巴彼此杂交配对，形成带缺口的含有目标基因的重组质粒载体；（4）步骤（3）得到的带缺口的含有目标基因的重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。

【技术特征摘要】
1.一种利用dI碱基进行基因克隆的方法，其特征在于，包括步骤为：（1）利用含有dI碱基的引物扩增目标基因和质粒载体；（2）利用内切核酸酶V或DNA糖苷酶AlkA对步骤（1）得到的PCR扩增后的目标基因和质粒载体在dI碱基处切断DNA链，得到目标基因的单链DNA尾巴和质粒载体的单链DNA尾巴；（3）将步骤（2）得到的目标基因的单链DNA尾巴和质粒载体的单链DNA尾巴彼此杂交配对，形成带缺口的含有目标基因的重组质粒载体；（4）步骤（3）得到的带缺口的含有目标基因的重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。2.根据权利要求1所述的利用dI碱基进行基因克隆的方法，其特征在于，步骤（1）中所述含有dI碱基的引物的序列为：（a）5’端第10-15位的碱基为1个dI碱基；（b）扩增目标基因的正向引物与扩增质粒载体的正向引物5’端的第1-15位碱基序列彼此互补配对，扩增目标基因的反向引物与扩增质粒载体的反向引物5’端的第1-15位碱基序列彼此互补配对；（c）3’端下游碱基序列与所述目标基因和质粒载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对。3.根据权利要求1所述的利用dI碱基进行基因克隆的方法，其特征在于，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因的正向引物、用...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁慧，田文奇，
申请(专利权)人：苏州博睐恒生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32