一种人-Sin3相关多肽P18过表达质粒的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种人‑Sin3相关多肽P18(SAP18)过表达质粒的构建方法及其应用。该方法包括如下步骤：以SEQ ID No：2‑3为引物，GenBank登录号NC_10284的序列为模板，进行PCR扩增，获得目的基因；用限制性内切酶XbaI和Not I对PCR产物和pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑copRFP载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，即得过表达质粒。所得人‑Sin3相关多肽P18在制备预防或治疗卡波氏肉瘤的产品上的应用。本发明专利技术人为过表达内皮细胞的SAP18，能够明显抑制内皮细胞的迁移、侵袭能力和血管生成，SAP18可以作为诊疗KS的新的分子标记和药物靶点。

Construction and Application of a Human-Sin3 Related Peptide P18 Overexpression Plasmid

The invention discloses a method for constructing an overexpression plasmid of human Sin3-related polypeptide P18 (SAP18) and its application. The method includes the following steps: using SEQ ID No:2_3 as primer and GenBank logon number NC_10284 as template to amplify the target gene by PCR; using restriction endonucleases XbaI and Not I to digest, purify and connect the PCR products and pCDH_CMV_MCS_EF1_copRFP vector, and then transform them into E. coli, which is the over-expressed plasmid. Application of human Sin3-related polypeptide P18 in the preparation of products for the prevention or treatment of Kaposi's sarcoma. The SAP 18 artificially overexpressing endothelial cells can significantly inhibit the migration, invasion and angiogenesis of endothelial cells. SAP 18 can be used as a new molecular marker and drug target for diagnosis and treatment of KS.

【技术实现步骤摘要】
一种人-Sin3相关多肽P18过表达质粒的构建方法及其应用
本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种人-Sin3相关多肽P18过表达质粒的构建方法及其应用。
技术介绍
卡波氏肉瘤病毒(Kaposi’ssarcoma-associatedherpesvirus，KSHV)感染可以导致卡波氏肉瘤(Kaposi’ssarcoma，KS)的发生(Science(NewYork,NY)1994；266:1865-1869.)。KS组织病理学特征表现为，病灶组织中存在裂隙状血管、梭形细胞肉瘤样增生、红细胞外渗和大量含铁血黄素沉积(Science(NewYork,NY)1994；266:1865-1869.)。作为一种内皮细胞来源的恶性血管肉瘤，KS具有高度的的侵袭性和异常的血管增生特征(Arizonamedicine1981；38:902-904.)。尽管KS病灶组织中KSHV的检出率高达95％，但是KSHV感染诱导KS发病的详细机制目前尚不清楚。与此同时，KS也是艾滋病(AIDS)患者频繁发生的重要并发症，被称之为艾滋相关的卡波氏肉瘤(AIDS-relatedKS，AIDS-KS)。作为世界范围内AIDS患者最流行的恶性肿瘤，AIDS-KS其侵害部位皮损数量多，范围广，且极易播散转移至口腔、生殖器、胃肠道和肺部。AIDS-KS发展快、预后差、病死率极高，是最具侵袭性和传播性的KS类型。从KSHV感染进展到KS的形成主要包括四个过程：(1)病毒的初始感染过程；(2)病毒感染的内皮细胞发生增生、迁移；(3)炎症应答的诱导；(4)KS肿瘤的生成。血管增生不仅为KS肿瘤的生长提供了营养和氧气支持，而且为肿瘤的转移准备了特殊通道。单纯靶向KS肿瘤细胞的治疗，忽略了阻断肿瘤血管的生成，极易导致肿瘤的复发与转移。目前局部手术切除、放射治疗、细胞毒性和靶向药物治疗、抗HIV治疗(HAART)以及系统性化疗等方法，均不能彻底治愈KS。因此，从KSHV诱导内皮细胞侵袭与血管生成的机制这一角度探讨KS的防治策略，已成为亟待解决的科学问题。Sin3相关多肽P18(Sin3Aassociatedprotein18，SAP18)由153个氨基酸分子组成，含有一个半胱氨酸，分子量为17.56KDa，最早是在转录调节因子Sin3(transcriptionalregulatorSIN3，Sin3)相关蛋白的免疫共沉淀中被鉴定(Gene1998；207:267-275；Cell1997；89:357-364.)。研究表明，SAP18参与Sin3-组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase，HDAC)转录阻遏复合物形成，增强转录抑制，参与调节细胞分裂、胚胎发育和病毒复制(AmericanjournalofmedicalgeneticsPartA2003；123A:5-28；TheBiochemicaljournal2004；378:353-362；ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2002；99:5442-5447.)。SAP18还能招募Sin3A-哺乳动物的毛球族同族体1(mammaliantribbleshomolog1，TRIB1)复合物结合到微粒体TG转运蛋白(microsomalTGtransferprotein，MTTP)的调控序列，促进MTTP基因转录，参与脂质代谢过程(Journaloflipidresearch2015；56:1145-1152.)。另外，SAP18与富含丝氨酸RNA结合蛋白1(RNA-bindingproteinwithserine-richdomain1，RNPS1)和核凋亡性染色质浓缩诱导剂(apoptoticchromatincondensationinducerinthenucleus，Acinus)组成凋亡-剪接相关蛋白(apoptosis-andsplicing-associatedprotein，ASAP)复合物，参与调控细胞RNA代谢过程，包括转录、剪接、翻译以及无义介导的mRNA降解(nonsense-mediatedmRNAdecay，NMD)(Internationaljournalofbiologicalsciences2017；13:545-560.)。然而，SAP18是否在KSHV感染及KS肿瘤形成中发挥作用目前尚不清楚。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种人-Sin3相关多肽P18过表达质粒的构建方法及其应用。一种人-Sin3相关多肽P18(SAP18)过表达质粒的构建方法，包括如下步骤：以SEQIDNo：2-3为引物，GenBank登录号NC_10284的序列为模板，进行PCR扩增，获得目的基因；用限制性内切酶XbaI和NotI对PCR产物和pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，即得过表达质粒。作为改进的是，所述人-Sin3相关多肽P18的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。作为改进的是，所述PCR扩增条件为：95℃预变性5min，然后95℃10s，55℃30s，72℃1min条件下扩增30个循环，最后72℃延伸7min。作为改进的是，所述PCR产物与pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP载体的体积比为7:1。上述人-Sin3相关多肽P18(SAP18)过表达质粒表达的人-Sin3相关多肽P18在制备预防或治疗卡波氏肉瘤的产品上的应用。有益效果：与现有技术相比，本专利技术提供的SAP18在卡波氏肉瘤组织中呈现低水平表达，人为过表达内皮细胞的SAP18，能够明显抑制内皮细胞的迁移、侵袭能力和血管生成，因此，SAP18在KS发病过程中发挥重要作用，可以作为诊疗KS的新的分子标记和药物靶点。附图说明图1为SAP18的免疫组化结果图，其中，(a)正常皮肤组织，(b)KS组织；图2为Westernblotting图；图3为过表达SAP18的内皮细胞迁移实验结果示意图，(a)Transwell迁移实验中于接种12h后迁移至小室底部的pCDH细胞；(b)Transwell迁移实验中于接种12h后迁移至小室底部的SAP18细胞；(c)迁移至小室底部的细胞结果统计；图4为过表达SAP18的内皮细胞侵袭实验结果示意图，(a)Transwell侵袭实验中于接种12h后迁移至小室底部的pCDH细胞；(b)Transwell侵袭实验中于接种12h后迁移至小室底部的SAP18细胞；(c)迁移至小室底部的细胞结果统计；图5为过表达SAP18的内皮细胞微管形成实验结果示意图，(a)微管形成实验中于接种6h后pCDH细胞；(b)微管形成实验中于接种6h后SAP18细胞；(c)微管形成的结果统计。具体实施方式下面结合具体实例对本专利技术的发酵方法进行详细描述和说明。其内容是对本专利技术的解释而非限定本专利技术的保护范围。实施例1SAP18在卡波氏肉瘤组织中的表达1、材料1.1组织本专利技术的临床KS组织和正常皮肤组织标本来自于南京医科大学第一附属医院。所有标本的使用均由患者或其委托人签署知情同意书，得到了南京医科大学医学伦理委员会批本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人‑Sin3相关多肽P18过表达质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：以SEQ ID No：2‑3为引物，GenBank登录号NC_10284的序列为模板，进行PCR扩增，获得目的基因；用限制性内切酶Xba I和Not I对PCR产物和pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑copRFP载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，即得质粒。

【技术特征摘要】
1.一种人-Sin3相关多肽P18过表达质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：以SEQIDNo：2-3为引物，GenBank登录号NC_10284的序列为模板，进行PCR扩增，获得目的基因；用限制性内切酶XbaI和NotI对PCR产物和pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，即得质粒。2.根据权利要求1所述的人-Sin3相关多肽P18过表达质粒的构建方法，其特征在于，所述人-Sin3相关多肽P18的核苷酸序列如SEQIDNo：1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李婉，卢春，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32