用于合成和检测核酸的组合物、方法和试剂盒技术

本文提供用于合成、检测和/或定量核酸的组合物、方法和试剂盒。实施例包含核酸扩增组合物，其包含热稳定DNA聚合酶和改善粗提取物或粗裂解物样品中的核酸靶标的核酸合成、扩增、检测和/或定量的试剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于合成和检测核酸的组合物、方法和试剂盒相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2016年4月6日提交的美国临时专利申请第62/319,151号的优先权的利益，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
本教导属于分子生物学和遗传分析的领域。本专利技术涉及可用于合成核酸的组合物、方法和试剂盒。更具体地说，提供了用于扩增、检测和/或定量核酸分子的组合物、方法和试剂盒，所述核酸分子尤其是那些具有低拷贝数(copynumber)和/或如在粗裂解物中存在抑制物的情况下的核酸分子。
技术介绍
在其最简单的形式下，聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是用于使用两个寡核苷酸引物来酶促合成特异性DNA序列的体外方法，所述两个寡核苷酸引物与相对链杂交并位于靶DNA中的靶标区域的侧面。包括模板变性(templatedenaturation)、引物退火和DNA聚合酶延伸退火引物的一系列重复的反应步骤引起特异性片段的指数积累，所述特异性片段的末端由引物的5'端限定。PCR能够产生109倍选择性富集的特异性DNA序列。参见例如美国专利第4,683,202号、第4,683,195号、第4,800,159和第4,965,188，和Saiki等人，1985，《科学(Science)》230:1350。市售PCR主混合物提高了效率并减小了与高通量分析所需的大量PCR反应的组装相关的误差。这些主混合物含有所有PCR反应共用的试剂的组合。举例来说，主混合物可以含有缓冲剂、盐如MgCl2、脱氧核苷三磷酸(dNTP)和热稳定DNA聚合酶。主混合物通常作为浓缩溶液或冻干粉末来制造和分配，随后在组装最终反应时稀释或溶解。对于准确的核酸分析，PCR主混合物应提供可靠的稳健的并且可重复的PCR结果。此外，PCR主混合物应允许检测低拷贝数靶核酸。举例来说，许多医学、诊断和法医应用依赖于样品中的特定DNA序列的扩增，在所述样品中序列以非常低的量存在。另外，许多这类应用依赖于从粗制或未纯化样品如细胞或组织粗裂解物的核酸序列的扩增。因此，需要利用所有类型的核酸样品来可靠地发挥作用的PCR组合物，所述样品包括粗制样品制剂和/或那些具有少量靶标的样品。
技术实现思路
本文提供了用于通过聚合酶依赖性核酸合成(包括例如使用聚合酶链式反应(PCR))来合成、检测和/或定量核酸的组合物、试剂盒和方法。在一些实施例中，本文提供了包含DNA聚合酶、盐、消泡剂和dNTP与dNTP衍生物的组合的组合物。在某些实施例中，本教导提供了包含热稳定DNA聚合酶的组合物。在一些实施例中，热稳定DNA聚合酶选自以下：TaqDNA聚合酶；TneDNA聚合酶；TmaDNA聚合酶；PfuDNA聚合酶；KODDNA聚合酶；TflDNA聚合酶；TthDNA聚合酶；Stoffel片段DNA聚合酶；VENTTMDNA聚合酶；DEEPVENTTMDNA聚合酶；和其突变体、变异体或衍生物。在一些实施例中，热稳定DNA聚合酶是Taq衍生的DNA聚合酶。在某些实施例中，本教导提供了包含钾盐、镁盐和/或钠盐的组合物。在一些实施例中，盐浓度是约5mM到约200mM。在一些实施例中，所述组合物包含硅酮基消泡剂。在一些实施例中，硅酮基消泡剂选自以下：AFE-1010、AFE-1430、AFE-1510、AFE-1520、AFE-2210、消泡剂A、消泡剂B、消泡剂C、消泡剂H-10、消泡剂SE-15、消泡剂SE-35、消泡剂SO-25、消泡剂Y-30和消泡剂289。在一些实施例中，所述组合物包含非硅酮基消泡剂。在一些实施例中，非硅酮基消泡剂选自以下：有机磺酸酯、聚醚、有机磷酸酯、炔二醇、碳氟化合物、聚烯烃多胺和聚亚烷基亚胺化合物，包括但不限于消泡剂204和消泡剂O-30。在一些实施例中，消泡剂的浓度是约0.001％到0.1％。在一些实施例中，dNTP选自dGTP、dCTP、dATP和dTTP。在一些实施例中，dNTP是dGTP。在一些实施例中，dGTP的浓度是0.05mM到1.0mM在一些实施例中，dNTP衍生物选自以下：7-脱氮-2-脱氧-GTP、7-脱氮-dATP、α-硫代dATP、α-硫代dTTP、α-硫代dGTP和α-硫代dCTP。在一些实施例中，dNTP衍生物是7-脱氮-2-脱氧-GTP。在一些实施例中，dNTP衍生物是7-脱氮-2-脱氧-dGTP。在一些实施例中，7-脱氮-2-脱氧-dGTP的浓度是0.05mM到1.0mM。在一些实施例中，所述组合物包含呈约1:2到约2:1比率的dGTP和7-脱氮-2-脱氧-dGTP。在一些实施例中，所述组合物包含呈约1:2到约1:10比率的dGTP和7-脱氮-2-脱氧-dGTP。在一些实施例中，所述组合物包含呈约2:1到约10:1比率的dGTP和7-脱氮-2-脱氧-dGTP。在一些实施例中，所述组合物包含呈约1:1比率的dGTP和7-脱氮-2-脱氧-dGTP。在某些实施例中，所提供的组合物进一步包含PCR抑制物阻断剂。在一些实施例中，PCR抑制物阻断剂是蛋白质。在一些实施例中，PCR抑制物阻断蛋白质选自白蛋白、明胶和其组合。在一些实施例中，所述组合物包含明胶和血清白蛋白。在某些实施例中，明胶选自牛明胶、鱼明胶和其组合。在某些实施例中，牛明胶的浓度是0.01％到1.0％且/或所述鱼明胶的浓度是0.01％到1.0％。在一些实施例中，血清白蛋白是牛血清白蛋白。在某些实施例中，牛血清白蛋白的浓度是0.05mg/ml到5mg/ml。在某些实施例中，所提供的组合物进一步包含清洁剂。在一些实施例中，清洁剂是非离子型清洁剂。在一些实施例中，非离子型清洁剂选自以下组成的组：曲拉通(TRITON)X-诺纳德P-40(NonidetP-40)、吐温80(TWEEN80)、Brij30、Brij35和Brij58。在一些实施例中，非离子型清洁剂是除吐温-20之外的清洁剂。在一些实施例中，非离子型清洁剂以0.005％到0.1％的浓度存在于所述组合物中。在某些实施例中，所提供的组合物进一步包含被动参考对照染料(passivereferencecontroldye)。在一些实施例中，被动参考对照染料是荧光染料。在一些实施例中，被动荧光被动参考染料是ROX染料或MUSTANGPURPLE染料。在一些实施例中，被动参考染料的浓度是约25nM到约500nM。在某一个实施例中，本教导提供了包含以下的组合物：热稳定DNA聚合酶、氯化钾、包含硅的消泡剂、dGTP和7-脱氮-2-脱氧-dGTP(其中7-脱氮-2-脱氧-dGTP的浓度是约0.05mM到1.0mM)、除吐温-20之外的非离子型清洁剂、呈0.01％到1.0％浓度的牛明胶、呈0.01％到1.0％浓度的鱼明胶和呈0.05mg/ml到5.0mg/ml浓度的牛血清白蛋白。在某些实施例中，本教导提供了用于进行核酸合成的方法，其包含使本文所提供的组合物与包含靶多核苷酸的生物样品以及靶特异性引物以任何顺序或组分的组合形式接触以形成反应混合物，并在反应混合物中进行核酸合成反应以形成扩增产物。在一些实施例中，核酸合成反应是聚合酶链式反应(PCR)。在一些实施例中，核酸合成反应是扩增反应。在一些实施例中，核酸合成反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，其包含：(a)至少一种DNA聚合酶；(b)至少一种盐；(c)至少一种消泡剂；(d)至少一种dNTP；和(e)至少一种dNTP衍生物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.06 US 62/319,1511.一种组合物，其包含：(a)至少一种DNA聚合酶；(b)至少一种盐；(c)至少一种消泡剂；(d)至少一种dNTP；和(e)至少一种dNTP衍生物。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述DNA聚合酶是热稳定DNA聚合酶。3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述热稳定DNA聚合酶选自TaqDNA聚合酶；TneDNA聚合酶；TmaDNA聚合酶；PfuDNA聚合酶；KODDNA聚合酶；TflDNA聚合酶；TthDNA聚合酶；Stoffel片段DNA聚合酶；VENTTMDNA聚合酶；DEEPVENTTMDNA聚合酶；和其突变体、变异体或衍生物。4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述热稳定DNA聚合酶是Taq衍生的DNA聚合酶。5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述盐选自钾盐、镁盐、钠盐和其任何组合。6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述盐的总浓度是5mM到200mM。7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述消泡剂是硅酮基消泡剂。8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述硅酮基消泡剂选自AFE-1010、AFE-1430、AFE-1510、AFE-1520、AFE-2210、消泡剂A、消泡剂B、消泡剂C、消泡剂H-10、消泡剂SE-15、消泡剂SE-35、消泡剂SO-25、消泡剂Y-30和消泡剂289。9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述消泡剂是非硅酮基消泡剂。10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述非硅酮基消泡剂选自有机磺酸酯、聚醚、有机磷酸酯、炔二醇、碳氟化合物、聚烯烃多胺和聚亚烷基亚胺化合物。11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述聚亚烷基亚胺化合物是消泡剂204或消泡剂O-30。12.根据权利要求7或9所述的组合物，其中所述消泡剂的浓度是0.001％到0.1％。13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述dNTP是dGTP。14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述dNTP衍生物是7-脱氮-dGTP(7-脱氮-2-脱氧-dGTP)。15.根据权利要求13所述的组合物，其中所述dGTP的浓度是0.05mM到1.0mM。16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述7-脱氮-dGTP的浓度是0.05mM到1.0mM。17.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含呈1:2到2:1比率的dGTP和7-脱氮-dGTP。18.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含呈1:2到1:10比率的dGTP和7-脱氮-dGTP。19.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含呈2:1到10:1比率的dGTP和7-脱氮-dGTP。20.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物进一步包含PCR抑制物阻断剂。21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述PCR抑制物阻断剂是蛋白质。22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述PCR抑制物阻断蛋白选自白蛋白、明胶和其组合。23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述组合物包含明胶和血清白蛋白。24.根据权利要求22所述的组合物，其中所述明胶选自牛明胶、鱼明胶和其组合。25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述牛明胶的浓度是0.01％到1.0％和/或所述鱼明胶的浓度是0.01％到1.0％。26.根据权利要求23所述的组合物，其中所述血清白蛋白是牛血清白蛋白。27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述牛血清白蛋白的浓度是0.05mg/ml到5mg/ml。28.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物进一步包含清洁剂。29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述清洁剂是非离子型清洁剂。30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述非离子型清洁剂选自以下组成的组：曲拉通(TRITON)诺纳德P-40(NonidetP-40)、吐温80、Brij30、Brij35和Brij58。31.根据权利要求29所述的组合物，其中所述清洁剂是除吐温-20之外的非离子型清洁剂。32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述非离子型清洁剂的浓度是.005％到0.1％。33.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物进一步包含被动参考对照染料。34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述被动参考对照染料是荧光染料。35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述荧光染料是ROX染料或MLUSTANGPURPLE染料。36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述被动参考染料的浓度是50nM到500nM。37.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物进一步包含dATP、dGTP、dCTP和/或dUTP。38.一种用于进行核酸合成反应的方法，其包含：(a)使根据前述权利要求中任一项所述的组合物与含有靶多核苷酸的生物样品以及靶特异性引物接触以形成反应混合物；和(b)进行核酸合成。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述核酸合成反应是聚合酶链式反应(PCR)。40.根据权利要求38所述的方法，其中所述核酸合成反应是扩增反应。41.根据权利要求38所述的方法，其中所述生物样品是裂解物。42.根据权利要求38所述的方法，其中所述方法进一步包含(c)使用所述扩增产物确定所述靶多核苷酸的基因型。43.根据权利要求38所述的方法，其中所述方法进一步包含(c)使用所述扩增产物确定所述靶多核苷酸的拷贝数...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·勒，K·拉马默里希，J·威尔德，N·范廷，J·朗，D·杜邦，J·史蒂文斯，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US