微小亚历山大藻代谢产物－膝沟藻毒素的分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了微小亚历山大藻代谢产物－膝沟藻毒素的分离纯化方法，包括制备粗提取液、除杂净化、分离纯化，制备粗提取液步骤为：取微小亚历山大藻培养液，滤取藻细胞，加入乙醇溶液，超声提取，提取液过滤，合并过滤液，以含少量醋酸的乙醇溶液萃取，萃取液去盐去脂后，‑20至‑25℃下保存；除杂净化步骤为：将粗提取液利用凝胶色谱净化，将得到的膝沟藻毒素液干燥浓缩；分离纯化步骤为：经干燥浓缩后的毒素分液进行两次离子交换色谱分离纯化得膝沟藻毒素GTX4、GTX1、GTX2、GTX3。有益效果：本发明专利技术能够快速高效地从微小亚历山大藻中将膝沟藻毒素进行提取分离，且该方法分离得不同结构的膝沟藻毒素纯度高。

【技术实现步骤摘要】
微小亚历山大藻代谢产物－膝沟藻毒素的分离纯化方法
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及微小亚历山大藻代谢产物－膝沟藻毒素的分离纯化方法。技术背景自1957年石房蛤毒素(SaxitoxinSTX)首次被发现，共有57种麻痹性贝类毒素(paralyticshellfishtoxinsPSTs)同系物被记载。麻痹性贝类毒素是一类具有神经麻痹作用的生物碱，其中毒机理是毒素结合了钠离子通道结构，阻碍了钠离子的流动。中毒后没有解药，唯一的解救方法是人工呼吸和输液。PSTs因其毒性强烈、无色无味且具有麻痹作用，在军事上有应用于生化武器的可能性，在医疗上则作为探索新型麻醉剂的前体物质，而在环境和食品检测方面，国外已有部分PSTs毒素标准品出售，但售价昂贵。麻痹性贝类毒素在医用方面具有广泛的应用。一方面环境保护、食品安全方面需要防止这类毒素的危害，另一方面，由于其强烈的生理活性，又可以加以利用。在毒素药用方面，类似于芋螺毒素，以麻痹性贝类毒素为先导化合物，开发毒性小、活性高的生物制品是当前研究的热点之一。由于具有麻痹作用，STX因此具有开发新型麻醉剂的可能。为了克服毒性问题，可将STX制成脂质体试剂，STX脂质体试剂具有缓慢释放的特性，有望应用于临床。膝沟藻毒素GTX2/3同样具有临床潜能，它们被用来治疗肛裂是比较安全和有效的，也可被用来治疗慢性紧张型头痛。随着越来越多的毒素被发现，麻痹性贝类毒素的应用价值会进一步的提升，展现出良好的应用前景。麻痹性贝类毒素主要产生于微藻，通过对有害微藻产毒因素的探究，人们可以更好地预警有害赤潮的爆发和影响，降低财产损失和健康风险；也可以探索选育产毒能力高的产毒藻，制备标品，应用于科研及医学检验。因此，对产麻痹性贝类毒素的有害藻类生长和产毒影响因素进行相应的研究有着重要意义。微小亚历山大藻作为一种藻类，可以提供膝沟藻毒素，大量的培养微小亚历山大藻可以为获取膝沟藻毒素提供基础准备，但是，膝沟藻毒素不能由亚历山大微藻直接获得，而是需要采用亚历山大微藻以提取分离及纯化才能得到能够应用于生产生活以满足实际需要的膝沟藻毒素。而目前缺乏一种能够快速高效地从微小亚历山大藻中将膝沟藻毒素进行提取分离的方法。现有技术如授权公告号为CN106324154B的中国专利技术专利，公开了一种分子印迹固相萃取-液质联用检测膝沟藻毒素的分析方法，属于生物样品前处理及化学分析检测领域。该方法利用分子印迹聚合构筑与印迹分子有高度相似性的三维孔穴和特定识别位点，从而实现对印迹分子的选择识别，提高了对目标物富集和去除干扰物的效率；并开发了以氰基柱为色谱分离柱的液质联用检测目标物的分析方法，利用氰基柱在反相使用时具有较强极性，可有效分离样品中的极性目标物和杂质，然后根据优化好的液质条件得到膝沟藻毒素在色谱柱上更好的分离效果及质谱检测效果。然而，该方法对不同结构的膝沟藻毒素分离效果差。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够快速高效地从微小亚历山大藻中将膝沟藻毒素进行提取分离的方法，且该方法分离得不同结构的膝沟藻毒素纯度高。膝沟藻毒素的结构见图1。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：微小亚历山大藻代谢产物－膝沟藻毒素的分离纯化方法，包括制备粗提取液、除杂净化、分离纯化，具体步骤如下：制备粗提取液：取微小亚历山大藻培养液，进行抽滤机滤取藻细胞，加入乙醇溶液，于60-100℃超声提取3-5次，提取液过滤，合并过滤液，以95％的含少量醋酸的乙醇溶液(pH为2)萃取30-60min，萃取液去盐去脂后，置于-20至-25℃下保存。除杂净化：将粗提取液利用凝胶色谱净化，洗脱提取液中的杂质，然后将得到的膝沟藻毒素液干燥浓缩。分离纯化：经干燥浓缩后的毒素分液进行两次离子交换色谱分离纯化得膝沟藻毒素GTX4、GTX1、GTX2、GTX3。作为优选，微小亚历山大藻培养所用培养液为K培养液，经高温高压(126℃，20min)灭菌，待冷却后接种；于温度24±2℃，照度1000-4000lux，光周期8-10L/14d的条件下培养；定期以血球记数器进行藻细胞记数；每周分植一次，以获得生长力旺盛的微小亚历山大藻；该条件下培养的藻株具有高的产毒率，能够提供高纯度的膝沟藻毒素。作为优选，提取用乙醇溶液中含有质量浓度为0.06-0.1％的2-异丙酯-3-苯基丙烯醇和0.02-0.05％的乙二醇单苯醚，2-异丙酯-3-苯基丙烯醇和乙二醇单苯醚一方面能够提高微小亚历山大藻细胞在乙醇中的分散性，使得均匀分散在溶剂中的细胞能够受到超声作用所产生的更多点位的剪切力和对细胞的压撞，从而提高细胞破碎的力度，提高膝沟藻毒素的得率；另一方面能够微溶解微小亚历山大藻细胞壁中的果胶质和纤维质，使得乙醇溶液进入细胞，随着细胞内渗透压逐渐增大，细胞破碎，提高了提取速率和效率。作为优选，凝胶色谱色谱柱选用2.6cm(ID)×30cm,填充物为Bio-GelP2(400mesh)；取干重45-50gBio-GelP2胶体粉末浸泡于去离子水中，使其充分浸润膨胀，脱气后充填；然后以去离子水预洗10-12h，流速1-3为mL/min。作为优选，凝胶色谱净化过程为：取粗提取液，加少量去离子水搅拌后上样，先以300-400mL去离子水洗脱，流速0.6-1.0mL/min，随后改用0.1-0.15mol/L的醋酸溶液洗脱，洗脱液以分液收集器收集，每15min收集一管，所收集的分液先用荧光点检验法检测，有荧光反应的分液再用HPLC法检测；收集含毒分液进行干燥浓缩；先用中性的去离子水洗脱，可以除去提取液中的色素及其他杂质，然后用一定浓度的醋酸溶液洗脱，可将含毒分液集中在少数几管中，毒素浓度提高增强了荧光反应，可以迅速简便的找到含毒分液，简化了处理过程。进一步地，洗脱用醋酸溶液中含有摩尔浓度0.05-0.08‰的R(+)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸和0.001-0.006‰的硝酸异山梨酯，R(+)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸和硝酸异山梨酯的特殊存在能够快速吸附膝沟藻毒素中C-8位上的胍基发生螯合，使毒素富集随醋酸溶液洗脱出，而其他杂质分子由于难洗脱仍留在Bio-GelP2胶体，不仅提高了毒素的分离速率，还保证了毒素的净化效率；此外，由于吸附基团与C-8位上的胍基螯合(在中性或碱性溶液中也可实现)，使得此胍基去质子化程度大大降低，从而阻碍了GTX4与GTX1及GTX2与GTX3互变异构的倾向，降低了不同结构毒素的损失，最终可得到不同结构和含量的膝沟藻毒素。作为优选，离子交换色谱色谱柱选用2.5cm(ID)×20cm，填充物为阳离子交换树脂Bio-Rex70(400mesh)；取Bio-Rex70树脂30-35g，浸泡于180-200mL去离子水中，以10-15mol/L浓盐酸滴定至pH为1，脱气后填充于柱子中，然后以去离子水预洗至pH值稳定后上样；用醋酸溶液梯度洗脱，醋酸溶液浓度120min内从0变到0.025mol/L，每分钟收集一管，用HitachiL-4200紫外-可见光检测器在线检测，检测波长UV235nm，同时配合高效液相色谱法分析；收集纯的GTX-4，GTX-1，GTX-3，GTX-2分液，保存于-20至-25℃冰箱中；Bio-Rex70为弱酸性阳离子交换树脂，负价官能团本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.微小亚历山大藻代谢产物－膝沟藻毒素的分离纯化方法，包括制备粗提取液、除杂净化、分离纯化，其特征在于：所述除杂净化步骤为：将粗提取液利用凝胶色谱净化，将得到的膝沟藻毒素液干燥浓缩。

【技术特征摘要】
1.微小亚历山大藻代谢产物－膝沟藻毒素的分离纯化方法，包括制备粗提取液、除杂净化、分离纯化，其特征在于：所述除杂净化步骤为：将粗提取液利用凝胶色谱净化，将得到的膝沟藻毒素液干燥浓缩。2.根据权利要求1所述的微小亚历山大藻代谢产物－膝沟藻毒素的分离纯化方法，其特征在于：所述凝胶色谱净化过程中醋酸洗脱溶液中含有摩尔浓度0.05-0.08‰的R(+)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸和0.001-0.006‰的硝酸异山梨酯。3.根据权利要求1或2所述的微小亚历山大藻代谢产物－膝沟藻毒素的分离纯化方法，其特征在于：所述凝胶色谱净化过程为：取粗提取液，加少量去离子水搅拌后上样，先以300-400mL去离子水洗脱，流速0.6-1.0mL/min，随后用0.1-0.15mol/L的醋酸溶液洗脱，洗脱液以分液收集器收集，每15min收集一管，所收集的分液先用荧光点检验法检测，有荧光反应的分液再用HPLC法检测。4.根据权利要求1所述的微小亚历山大藻代谢产物－膝沟藻毒素的分离纯化方法，其特征在于：所述制备粗提取液步骤为：取微小亚历山大藻培养液，滤取藻细胞，加入乙醇溶液，超声提取，提取液过滤，合并过滤液，以含少量醋酸的乙醇溶液萃取，萃取液去盐去脂后，-20至-25℃下保存。5.根据权利要求4所述的微小亚历山大藻代谢产物－膝沟藻毒素的分离纯化方法，其特征在于：所述微小亚历山大藻培养所用培养液为K培养液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗红宇，王志高，余新威，王亚军，王春利，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33