一种用于检测地沟油中辣椒碱的免疫层析试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测地沟油中辣椒碱的免疫层析试纸条及其制备方法，该试纸条包括支撑体和固定在支撑体上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水材料层，在纤维素膜层上设有用偶联辣椒碱的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，以及用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述金标抗体纤维层采用吸附金标抗体的玻璃纤维棉制成，金标抗体为纳米金颗粒标记的辣椒碱单克隆抗体或多克隆抗体。本发明专利技术试纸条特异性强、灵敏度高(可检测到1.7ng/mL的辣椒碱)，操作简便、检测快速(5min内即可判定检测结果)，结果显示形象、直观、准确，适用范围广，便于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测地沟油中辣椒碱的免疫层析试纸条及其制备方法
本专利技术涉及一种免疫层析试纸，特别是涉及一种用金标纳米颗粒标记辣椒碱抗体的免疫层析试纸条及其制备方法。
技术介绍
近年来，随着人民生活水平的不断提高，人们对食用油的需求量和消费量都不断增加，产生的废弃油脂也大量增加。许多不法分子将泔水油、煎炸老油、猪、牛下水油等收集起来，经过精炼加工，将地沟油充当食用油进行违法销售的犯罪行为近年来屡有发生。不仅损害了消费者的利益、干扰了我国废弃油脂的管理秩序，更给人民群众的身体健康带来了巨大的威胁。由于饮食习惯和口味爱好，辣椒是各种调料中用量较大、适用范围较广的一种。辣椒碱是引起辣味的主要化学成分，其热稳定性好、脂溶性强、沸点高，在正常使用植物油中本身不存在，且很难被目前的地沟油加工工艺完全去除。因此可以作为鉴别餐厨废弃油的特异性指标。目前，用于辣椒碱残留检测的方法较多，如(1)理化分析方法，如高压液相色谱法、气相色谱法、薄层层析法、电泳法等；(2)免疫分析法，如放射免疫法、酶联免疫吸附法等；(3)生物测定等。这些方法需要昂贵的仪器设备，需要熟练的专业人员操作，过程复杂，时间较长，限制了其应用范围，难以在生产中推广应用。免疫层析检测法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待测物的初步信息，该法灵敏度高，分析过程相对简单，用作辣椒碱的筛查有独特的优势，是需要优先发展的检测技术，但目前商业化辣椒碱免疫层析检测试纸条在国内尚属空白，急待研究解决。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种用于检测地沟油中辣椒碱的免疫层析试纸条及其制备方法，该试纸条具有特异、灵敏、快速、简便定量检测微量辣椒碱的特点。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种用于检测地沟油中辣椒碱的免疫层析试纸条，包括支撑体和固定在支撑体上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水材料层，其特征在于，在纤维素膜层上设有用偶联辣椒碱的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，以及用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述金标抗体纤维层采用吸附金标抗体的玻璃纤维棉制成，金标抗体为纳米金颗粒标记的辣椒碱单克隆抗体或多克隆抗体。支撑体包括设置在吸附层底面的底层和设置在吸附层顶面的面层。偶联辣椒碱的载体蛋白是先采用琥珀酸酐法合成辣椒碱-HS，再用活化酯法，将辣椒碱与载体蛋白进行偶联制备而成，具体方法为：(1)称取26g辣椒碱和13g琥珀酸酐置于500mL反应瓶中，加入100mL二甲基亚砜作为溶剂，90℃反应1h；将反应液冷却至室温，滴加至400mL蒸馏水中，边滴加边搅拌，溶液中析出淡黄色沉淀；抽滤沉淀，用冰蒸馏水洗涤后抽干，50℃烘干，用蒸馏水进行重结晶，重复三次，干燥得淡黄色针状结晶，即为辣椒碱-HS；(2)称取10mg辣椒碱-HS溶于500μLN，N-二甲基甲酰胺中，加入9mgN,N-二环己基碳二亚胺，再用200μLDMF溶解4mgN-羟基琥珀酰亚胺，将其滴加到上述溶液中，室温搅拌反应8h，此为反应液A；另称取20mgBSA或OVA或KLH溶于2mL0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液中，此为反应液B；将反应液B置于磁力搅拌器上，4℃下将反应液A滴加到反应液B中，搅拌反应过夜；次日将反应液置于处理过的透析袋内，在PBS中透析三天，离心弃沉淀，分装并贮于-20℃备用。偶联辣椒碱的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。纳米金颗粒的粒径为20～40nm。金标抗体的制备方法为：在沸腾的200mL质量分数0.01～0.02％氯金酸溶液中加入质量分数1％柠檬酸钠溶液8mL，获得胶体金溶液，然后用0.1mol/LK2CO3调pH值至8.5～9.5，以1：2000的标记比将辣椒碱单克隆抗体或多克隆抗体加入pH8.5～9.5的胶体金溶液中，标记10min后，加入质量分数20％的PEG10000至终浓度为0.05％，4℃、1500～3000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000rpm离心1h，弃上清，获初步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖凝胶S-400柱层析进行分离纯化，获得金标抗体。辣椒碱单克隆抗体的制备方法为：用辣椒碱载体蛋白偶联物免疫6～8周龄Balb/C小鼠3～4次，免疫剂量为每次50～100μg/只，免疫间隔时间3～5周，确定抗体效价符合要求后超强免疫，之后3～4天，将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清；脱颈致死，用体积分数75％的酒精浸泡小鼠5～10min消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，1000rpm离心10min，收集脾细胞；将1×108的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10：1的比例混合，1000rpm离心10min，弃上清，细胞沉淀物于37℃水浴中缓缓加入0.7～1.0mL的质量分数50％PEG4000，作用1min，然后加入无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用，37℃水浴5～10min，1000rpm离心10min，弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔细胞培养板孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养10～14天，用间接ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化，而后扩大培养，获得分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株。辣椒碱多克隆抗体的制备方法为：用辣椒碱载体蛋白偶联物免疫新西兰白兔，免疫剂量为每只200～500μg/次，背部皮下分4～6点注射；其中，首免，用无菌PBS溶解辣椒碱载体蛋白偶联物，与等量FCA混合，充分乳化；加强免疫，用无菌PBS溶解辣椒碱载体蛋白偶联物，与等量FIA混合，充分乳化；首免后2～3周进行连续加强免疫4～5次，每次间隔2～3周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清；以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，即取1体积高免血清加2体积pH7.2PBS混匀，加等体积饱和硫酸铵溶液混匀，置4℃冰箱12h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清；再以pH7.2PBS溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33％，置4℃冰箱2h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清；以pH7.2PBS溶解沉淀，置4℃冰箱内用pH7.2PBS透析48～72h，中间换液数次，4℃、12000rpm离心15min，收集上清，得纯化的辣椒碱多克隆抗体。一种用于检测地沟油中辣椒碱的免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：(1)辣椒碱载体蛋白偶联物的制备：(a)称取26g辣椒碱和13g琥珀酸酐置于500mL反应瓶中，加入100mL二甲基亚砜作为溶剂，90℃反应1h；将反应液冷却至室温，滴加至400mL蒸馏水中，边滴加边搅拌，溶液中析出淡黄色沉淀；抽滤沉淀，用冰蒸馏水洗涤后抽干，50℃烘干，用蒸馏水进行重结晶，重复三次，干燥得淡黄色针状结晶，即为辣椒碱-HS；(b)称取10mg辣椒碱-HS溶于500μLN，N-二甲基甲酰胺中，加入9mgN,N-二环己基碳二亚胺，再用200μLDMF溶解4mgN-羟基琥珀酰亚胺，将其滴加到上述溶液中，室温搅拌反应8h，此为反应液A；另称取20mgBSA或O本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测地沟油中辣椒碱的免疫层析试纸条，包括支撑体和固定在支撑体上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为吸附纤维层(1)、金标抗体纤维层(2)、纤维素膜层(3)及吸水材料层(4)，其特征在于，在纤维素膜层上设有用偶联辣椒碱的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹(5)，以及用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹(6)；所述金标抗体纤维层采用吸附金标抗体的玻璃纤维棉制成，金标抗体为纳米金颗粒标记的辣椒碱单克隆抗体或多克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测地沟油中辣椒碱的免疫层析试纸条，包括支撑体和固定在支撑体上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为吸附纤维层(1)、金标抗体纤维层(2)、纤维素膜层(3)及吸水材料层(4)，其特征在于，在纤维素膜层上设有用偶联辣椒碱的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹(5)，以及用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹(6)；所述金标抗体纤维层采用吸附金标抗体的玻璃纤维棉制成，金标抗体为纳米金颗粒标记的辣椒碱单克隆抗体或多克隆抗体。2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，支撑体包括设置在吸附层底面的底层(7)和设置在吸附层顶面的面层(8)。3.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，偶联辣椒碱的载体蛋白是先采用琥珀酸酐法合成辣椒碱-HS，再用活化酯法，将辣椒碱与载体蛋白进行偶联制备而成，具体方法为：(1)称取26g辣椒碱和13g琥珀酸酐置于500mL反应瓶中，加入100mL二甲基亚砜作为溶剂，90℃反应1h；将反应液冷却至室温，滴加至400mL蒸馏水中，边滴加边搅拌，溶液中析出淡黄色沉淀；抽滤沉淀，用冰蒸馏水洗涤后抽干，50℃烘干，用蒸馏水进行重结晶，重复三次，干燥得淡黄色针状结晶，即为辣椒碱-HS；(2)称取10mg辣椒碱-HS溶于500μLN，N-二甲基甲酰胺中，加入9mgN,N-二环己基碳二亚胺，再用200μLDMF溶解4mgN-羟基琥珀酰亚胺，将其滴加到上述溶液中，室温搅拌反应8h，此为反应液A；另称取20mgBSA或OVA或KLH溶于2mL0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液中，此为反应液B；将反应液B置于磁力搅拌器上，4℃下将反应液A滴加到反应液B中，搅拌反应过夜；次日将反应液置于处理过的透析袋内，在PBS中透析三天，离心弃沉淀，分装并贮于-20℃备用。4.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，偶联辣椒碱的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。5.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，纳米金颗粒的粒径为20～40nm。6.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，金标抗体的制备方法为：在沸腾的200mL质量分数0.01～0.02％氯金酸溶液中加入质量分数1％柠檬酸钠溶液8mL，获得胶体金溶液，然后用0.1mol/LK2CO3调pH值至8.5～9.5，以1：2000的标记比将辣椒碱单克隆抗体或多克隆抗体加入pH8.5～9.5的胶体金溶液中，标记10min后，加入质量分数20％的PEG10000至终浓度为0.05％，4℃、1500～3000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000rpm离心1h，弃上清，获初步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖凝胶S-400柱层析进行分离纯化，获得金标抗体。7.根据权利要求6所述的免疫层析试纸条，其特征在于，辣椒碱单克隆抗体的制备方法为：用辣椒碱载体蛋白偶联物免疫6～8周龄Balb/C小鼠3～4次，免疫剂量为每次50～100μg/只，免疫间隔时间3～5周，确定抗体效价符合要求后超强免疫，之后3～4天，将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清；脱颈致死，用体积分数75％的酒精浸泡小鼠5～10min消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，1000rpm离心10min，收集脾细胞；将1×108的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10：1的比例混合，1000rpm离心10min，弃上清，细胞沉淀物于37℃水浴中缓缓加入0.7～1.0mL的质量分数50％PEG4000，作用1min，然后加入无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用，37℃水浴5～10min，1000rpm离心10min，弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔细胞培养板孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养10～14天，用间接ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化，而后扩大培养，获得分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株。8.根据权利要求6所述的免疫层析试纸条，其特征在于，辣椒碱多克隆抗体的制备方法为：用辣椒碱载体蛋白偶联物免疫新西兰白兔，免疫剂量为每只200～500μg/次，背部皮下分4～6点注射；其中，首免，用无菌PBS溶解辣椒碱载体蛋白偶联物，与等量FCA混合，充分乳化；加强免疫，用无菌PBS溶解辣椒碱载体蛋白偶联物，与等量FIA混合，充分乳化；首免后2～3周进行连续加强免疫4～5次，每次间隔2～3周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清；以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，即取1体积高免血清加2体积pH7.2PBS混匀，加等体积饱和硫酸铵溶液混匀，置4℃冰箱12h，4℃、2500rpm离心15min，弃上清；再以pH7.2PBS溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33％，置4℃冰箱2...

【专利技术属性】
技术研发人员：任飞，冯斌，刘庆华，刘斌，
申请(专利权)人：山西公大智检科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山西,14