一种血管扩张型刺激磷蛋白检测试剂盒制造技术

本申请涉及一种血管扩张型刺激磷蛋白检测试剂盒。所述试剂盒包含：包被有VASP单克隆抗体的磁颗粒、含有标记的VASP‑P单克隆抗体的酶工作液、裂解液、反应底物。所述试剂盒检测速度快、操作简便、灵敏度高、特异性好。

【技术实现步骤摘要】
一种血管扩张型刺激磷蛋白检测试剂盒
本申请属于分子免疫学领域，具体涉及一种血管扩张型刺激磷蛋白(以下简称VASP)检测试剂盒、以及VASP单克隆抗体及其用途。
技术介绍
随着我国社会经济发展，心脑血管疾病发病率呈逐年增高趋势，其高致残率和高死亡率对人民健康构成严重威胁并给社会带来沉重负担。大量临床试验和医学研究显示心脑血管疾病具有共同的危险因素和病理生理机制，其中血小板活化是发病和病程进展中的关键环节。因此积极抗血小板治疗已成为防治心血管疾病的核心策略之一。通过抑制血小板黏附、聚集和释放，抗血小板治疗实现防止血栓形成、降低缺血性心脑血管发生率的目的。现阶段常用的抗血小板药物包括如下几类：环氧化酶(COX)抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、二磷酸腺苷受体拮抗剂、糖蛋白IIb/IIIa拮抗剂、蛋白酶激活受体1拮抗剂、TXA2受体拮抗剂。VASP磷酸化检测法基于ADPP2Y12受体途径的活化，是特异性最高的P2Y12受体抑制剂检测方法，不受其他抗血小板药物的影响。因此，一种快速检测VASP磷酸化的方法对评价血小板功能以及对临床指导用药有重要的意义。VASP含有380个氨基酸，其结构主要包括3个部分：N端1(Ena/VASPhomology1，EVH1)区域、富含脯氨酸区域(poly-prolineregion，PPR)、C端2(Ena/VASPhomology2，EVH2)区域。EVH-1主要调节VASP、斑联蛋白、黏着斑蛋白之间的交互作用；VASP的中心区域与前纤维蛋白结合，通过后者与F肌动蛋白相连，PPR参与调节抑制蛋白和白蛋白；EVH2区域则通过影响细胞间的连接方式来调节肌动蛋白的结合，主要参与VASP对细胞运动的调节。VASP主要通过磷酸化进行功能调节，且由于其特殊的空间构成，使得VASP能够参与各类细胞中细胞骨架的调节。VASP含有以下5个明确受磷酸化调控的位点：酪氨酸39(Tyr，Y-39)、丝氨酸157(Ser，S)、S-239、苏氨酸278(Thr，T-278)、S-322。每个位点功能既彼此区别又相互协同，共同解释了VASP的功能作用。腺苷二磷酸通过与血小板膜上的P2Y12受体结合，促进腺苷酸环化酶生成，进而抑制环磷酸腺苷的合成，以促进血小板活化。氯吡格雷的药理机制即作用于血小板膜上P2Y12受体，通过促进VASP磷酸化而抑制血小板的活化。而前述环磷酸腺苷合成阶段，即可检测到VASP磷酸化的具体情况。根据此原理量化检测VASP的磷酸化程度，可据此计算出血小板反应指数。迅速、准确地判断患者血小板功能及其对抗血小板药物的反应，将有助于减少药物抵抗的发生，调整个体化抗血小板治疗，进一步降低血栓性及出血性事件的发生。Osmancik等通过VASP监测，对不同严重程度的急性心肌梗死患者的氯吡格雷效用进行评估。发现在服用负荷剂量的氯吡格雷后，血流动力学稳定的ST段抬高型心肌梗死患者，其VASP指数有明显的降低，认为患者的血小板功能在服用氯吡格雷后受到有效抑制。但对于血流动力学不稳定的患者(包括需用升压药物或机械通气支持者)，其VASP指数下降程度极为有限。因此，实现了精确评估的作用。Grdinic等人通过VASP检测发现，34％的高危经皮冠状动脉介入治疗患者在接受300mg负荷剂量的氯吡格雷后，出现了氯吡格雷抵抗。另有研究发现，支架内血栓的生成与高于50％的VASP指数有极紧密的相关性Bonello等通过VASP指数指导干预并观察主要不良心血管事件(majoradversecardiovascularevents，MACE事件)的发生情况。该研究还证实了VASP指数评估的高敏感性，可通过此方法对血小板功能进行简单而有效的评测。国内近年也有通过VASP检测氯吡格雷抵抗特异性的研究。结果显示，VASP对中国人群的检测特异性依然是可靠的。目前VASP检测主流产品为stago公司的PLTVASP/P2Y12，需要采用流式细胞仪进行检测，流式细胞技术和操作对人员和机器的要求较高导致花费较为昂贵、Stago公司也提供检测VASP的试剂盒，但反应时间较长，操作繁琐。CN1279691A公开了一种VASP抗体，其特异性结合在239丝氨酸位置磷酸化的VASP，是一种由杂交瘤细胞系DSMACC2330产生的单克隆抗体。CN106370839A公开了一种快速检测的量子点免疫层析试纸条。试纸条将磷酸化VASP单克隆抗体和量子点偶联物喷涂在玻璃纤维素膜上得到探针固定垫，VASP单克隆抗体包被在检测膜检测线上，羊抗鼠多克隆抗体包被在检测膜的质控线上。本申请仍然需要一种VASP检测试剂，能够满足检测速度快、操作简便、灵敏度高、特异性好，可以批量生产等特点。
技术实现思路
根据本申请的一些具体实施方案，提供了一种VASP单克隆抗体，其由2018年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCCNo.15791的杂交瘤细胞所产生。根据本申请的一些具体实施方案，提供了另一种VASP-P(磷酸化血管扩张型刺激磷蛋白)单克隆抗体，其由2018年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCCNo.15792的杂交瘤细胞所产生。在一个具体实施方案中，所述VASP-P是在239丝氨酸位置磷酸化的VASP。在一个具体实施方案中，所述VASP-P单克隆抗体识别并特异性结合239丝氨酸位置磷酸化的VASP。根据本申请的一些具体实施方案，提供了一种杂交瘤细胞，其2018年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCCNo.15791。根据本申请的一些具体实施方案，提供了另一种杂交瘤细胞，其2018年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCCNo.15792。根据本申请的一些具体实施方案，提供了本申请的VASP单克隆抗体在制备诊断试剂中的用途。根据本申请的一些具体实施方案，提供了本申请的杂交瘤细胞在制备诊断试剂中的用途。本申请的VASP单克隆抗体或VASP-P单克隆抗体可以单独用于制备检测或诊断试剂，然而优选组合用于制备检测或诊断试剂。在一些具体实施方案中，所述检测或诊断试剂是VASP检测试剂。VASP检测或诊断试剂是指用于定量或定性检测受试者样本中VASP的试剂。VASP检测或诊断试剂可检测人类样本中VASP的存在和/或含量。所述检测或诊断试剂可以是现有技术中任何适当的形式，包括但不限于ELISA检测试剂、免疫比浊检测试剂、磁颗粒检测试剂、化学发光检测试剂、放射免疫检测试剂、免疫荧光检测试剂。实际上，本申请的VASP单克隆抗体或VASP-P单克隆抗体或杂交瘤细胞可以用于制备任何基于抗原-抗体相互作用的检测试剂。在一些具体实施方案中，所述检测或诊断试剂可以体现为液体形式、干粉、冻干粉形式、颗粒形式、多孔板形式或其它本领域公知的形式。根据本申请的一些具体实施方案，提供了一种VASP检测试剂，其包含一种本申请的VASP单克隆抗体和/或VASP-P单克隆抗体的组合。根据本申请的一些具体实施方案，提供了一种VASP检测试剂盒，其包含本申请VASP单克隆抗体和VASP-P单克隆抗体的组合。根据本申请的一些具体实施方案，提供了一种VASP检测试剂盒，其包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血管扩张型刺激磷蛋白检测试剂盒，其包含：磁颗粒工作液、酶工作液、任选地，裂解液、任选地，反应底物；其中，所述磁颗粒工作液包含：0.15mg/ml至0.3mg/ml包被有VASP单克隆抗体的磁颗粒、缓冲液、氯化钠、表面活性剂、稳定剂、防腐剂；所述的酶工作液包含：标记的VASP‑P单克隆抗体、缓冲液、氯化钠、稳定剂、防腐剂；所述的裂解液包含：缓冲液、氯化钠、EDTA、NaF、NP40、防腐剂、pH 7至8；所述标记选自：辣根过氧化物酶标记、碱性磷酸酶标记、放射性标记、免疫荧光标记；所述的反应底物选自：邻苯二胺、ABTS、四甲基联苯胺、4氨基安替比林、BCIP/NBT；所述表面活性剂选自：吐温20、吐温80；所述缓冲液选自：Tris‑HCl、PBS；所述稳定剂选自：山羊血清、小牛血清、BSA、海藻糖；所述防腐剂选自：Proclin‑300、叠氮钠；优选地，所述VASP‑P包含磷酸化的239位丝氨酸；优选地，所述磁颗粒与所述VASP单克隆抗体的质量比为10：1至40：1，更优选20：1；优选地，所述包被有VASP单克隆抗体的磁颗粒浓度为0.2mg/ml；优选地，所述VASP单克隆抗体由2018年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC No.15791的杂交瘤细胞所产生，优选地，所述VASP‑P单克隆抗体由2018年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC No.15792的杂交瘤细胞所产生。...

【技术特征摘要】
1.一种血管扩张型刺激磷蛋白检测试剂盒，其包含：磁颗粒工作液、酶工作液、任选地，裂解液、任选地，反应底物；其中，所述磁颗粒工作液包含：0.15mg/ml至0.3mg/ml包被有VASP单克隆抗体的磁颗粒、缓冲液、氯化钠、表面活性剂、稳定剂、防腐剂；所述的酶工作液包含：标记的VASP-P单克隆抗体、缓冲液、氯化钠、稳定剂、防腐剂；所述的裂解液包含：缓冲液、氯化钠、EDTA、NaF、NP40、防腐剂、pH7至8；所述标记选自：辣根过氧化物酶标记、碱性磷酸酶标记、放射性标记、免疫荧光标记；所述的反应底物选自：邻苯二胺、ABTS、四甲基联苯胺、4氨基安替比林、BCIP/NBT；所述表面活性剂选自：吐温20、吐温80；所述缓冲液选自：Tris-HCl、PBS；所述稳定剂选自：山羊血清、小牛血清、BSA、海藻糖；所述防腐剂选自：Proclin-300、叠氮钠；优选地，所述VASP-P包含磷酸化的239位丝氨酸；优选地，所述磁颗粒与所述VASP单克隆抗体的质量比为10：1至40：1，更优选20：1；优选地，所述包被有VASP单克隆抗体的磁颗粒浓度为0.2mg/ml；优选地，所述VASP单克隆抗体由2018年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCCNo.15791的杂交瘤细胞所产生，优选地，所述VASP-P单克隆抗体由2018年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCCNo.15792的杂交瘤细胞所产生。2.根据权利要求1所述的血管扩张型刺激磷蛋白检测试剂盒，其中：所述磁颗粒工作液包含：0.2mg/ml包被有VASP单克隆抗体的磁颗粒、20mMPBS缓冲液、9g/L氯化钠、1ml/LTwe...

【专利技术属性】
技术研发人员：于晖，李雨心，谷明星，代晓曼，
申请(专利权)人：北京普恩光德生物科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11