一种检测有机磷农药多残留的免疫分析试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测有机磷农药多残留的免疫分析试剂盒，属于农药检测技术领域。所述试剂盒包括包被有抗原的黑色酶标板、胶体金探针溶液、洗液和二硫苏糖醇溶液；所述抗原包括三唑磷、对硫磷和毒死蜱；所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和以下任意一种特异性单克隆抗体的金纳米粒子；所述特异性单克隆抗体包括三唑磷抗体、对硫磷抗体和毒死蜱抗体；所述金纳米粒子表面修饰生物条形码的数量为130～170条；所述生物条形码标记有荧光基团；所述单克隆抗体与荧光基团的颜色之间存在唯一对应关系。本发明专利技术提供的试剂盒能在同一反应体系中对多种有机磷农药残留定量检测。

An Immunoassay Kit for Detecting Multi-residues of Organophosphorus Pesticides and Its Application

The invention provides an immunoassay kit for detecting multiple organophosphorus pesticide residues, which belongs to the technical field of pesticide detection. The kit comprises a black enzyme plate coated with antigen, colloidal gold probe solution, lotion solution and dithiothreotol solution; the antigen comprises triazophos, parathion and chlorpyrifos; the colloidal gold probe is a gold nanoparticle surface modified with a biological bar code and any of the following specific monoclonal antibodies; Heterosexual monoclonal antibodies include Triazophos antibody, parathion antibody and chlorpyrifos antibody; the number of gold nanoparticles surface modified biological barcode is 130-170; the biological barcode is labeled with fluorescent groups; there is only corresponding relationship between the monoclonal antibody and the color of fluorescent groups. The kit provided by the invention can quantitatively detect various organophosphorus pesticide residues in the same reaction system.

【技术实现步骤摘要】
一种检测有机磷农药多残留的免疫分析试剂盒及其应用
本专利技术属于农药检测
，具体涉及一种检测有机磷农药多残留的免疫分析试剂盒及其应用。
技术介绍
小分子化学污染物的多残留检测一直是免疫分析的重点和难点。目前主要有以下两种模式：(1)基于单一特异性抗体的模式。分别制备针对多个污染物的单一特异性抗体，通过酶标板上的不同微孔或者生物芯片上不同阵列实现不同目标物的区分，但不能实现同一反应体系的同时检测。(2)基于广谱特异性抗体的模式。只需要制备一种抗体，就可以同时测定多种污染物的总量，但不能实现分别定量，且可能会与非目标物有交叉反应。
技术实现思路
有鉴于
技术介绍
中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种既可以在同一反应体系中同时检测，又能实现分别定量的有机磷农药多残留检测方案。本专利技术提供了一种基于荧光寡核苷酸信号放大技术检测有机磷农药多残留的免疫分析试剂盒，所述试剂盒包括如下组成：包被有抗原的黑色酶标板、胶体金探针溶液、洗液和二硫苏糖醇溶液；所述抗原包括三唑磷、对硫磷和毒死蜱；所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和以下任意一种特异性单克隆抗体的金纳米粒子；所述特异性单克隆抗体包括三唑磷抗体、对硫磷抗体和毒死蜱抗体；所述金纳米粒子表面修饰生物条形码的数量为130～170条所述生物条形码标记有荧光基团；修饰有相同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被同一颜色的荧光基团标记；修饰有不同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被不同颜色的荧光基团标记。优选的，所述三唑磷的包被浓度为0.12～0.2mg/L，所述对硫磷的包被浓度为0.56～0.7mg/L，所述毒死蜱的包被浓度为0.8～0.94mg/L。优选的，所述胶体金探针溶液的摩尔浓度为8～10nmol/L；所述金纳米粒子的粒径为12～14nm。优选的，所述洗液含有体积分数0.1～1％吐温-20的0.005～0.015mol/L的PBS缓冲液。优选的，所述二硫苏糖醇溶液的摩尔浓度为18～22nmol/L。优选的，所述荧光基团包括6-FAM、CY-3和TEXASRed。优选的，所述试剂盒中还包括农药标准品。优选的，所述胶体金探针的制备方法包括胶体金的合成、生物条形码的活化、特异性单抗的标记和生物条形码的标记。本专利技术还提供了上述试剂盒在检测有机磷农药多残留中的应用。优选的，所述检测有机磷农药多残留的方法包括如下步骤：(1)向包被有抗原的黑色酶标板中加入待测样品和胶体金探针溶液，37℃孵育0.5～2h，用洗液洗板；(2)向所述步骤(1)洗板后的酶标板孔中加入二硫苏糖醇溶液，37℃振荡反应1～3h，检测不同颜色荧光基团的荧光信号，分别测定荧光值；(3)将测定的荧光值分别代入相应荧光信号的标准曲线形成的标准方程式中，计算得到不同类型有机磷农药残留的量。有益效果：本专利技术提供的有机磷农药多残留检测试剂盒包括包被有抗原的黑色酶标板、胶体金探针溶液、洗液和二硫苏糖醇溶液；所述抗原包括三唑磷、对硫磷和毒死蜱；所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和以下任意一种特异性单克隆抗体的金纳米粒子；所述特异性单克隆抗体包括三唑磷抗体、对硫磷抗体和毒死蜱抗体；所述金纳米粒子表面修饰生物条形码的数量为130～170条；所述生物条形码标记有荧光基团；修饰有相同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被同一颜色的荧光基团标记；修饰有不同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被不同颜色的荧光基团标记。利用本专利技术提供的试剂盒能在同一反应体系中实现对多种有机磷农药残留的同时检测。同时，本专利技术利用免疫学原理将抗原抗体的特异性结合与荧光寡核苷酸的信号放大技术结合起来，以不同的荧光标记对应不同的抗原，从而实现在同一反应体系检测多种不同抗原残留的同时，实现对多种不同抗原残留的分别定量。附图说明图1为本专利技术实施例1所述方案流程图。具体实施方式本专利技术提供了一种基于荧光寡核苷酸信号放大技术检测有机磷农药多残留的免疫分析试剂盒，所述试剂盒包括如下组成：包被有抗原的黑色酶标板、胶体金探针溶液、洗液和二硫苏糖醇溶液；所述抗原包括三唑磷、对硫磷和毒死蜱；所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和以下任意一种特异性单克隆抗体的金纳米粒子；所述特异性单克隆抗体包括三唑磷抗体、对硫磷抗体和毒死蜱抗体；所述金纳米粒子表面修饰生物条形码的数量为130～170条；所述生物条形码标记有荧光基团；修饰有相同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被同一颜色的荧光基团标记；修饰有不同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被不同颜色的荧光基团标记。本专利技术提供的免疫分析试剂盒包括包被有抗原的黑色酶标板，所述抗原包括三唑磷、对硫磷和毒死蜱。所述三唑磷的包被浓度优选为0.12～0.2mg/L，更优选为0.16mg/L，所述对硫磷的包被浓度优选为0.56～0.7mg/L，更优选为0.63mg/L，所述毒死蜱的包被浓度优选为0.8～0.94mg/L，更优选为0.87mg/L。在本专利技术中，所述包被有抗原的黑色酶标板优选按如下方法制备：将抗原溶液添加到酶标板中，包被，第一次洗板后用封闭液封闭，第二次洗板。在本专利技术中，所述抗原优选为三唑磷、对硫磷、毒死蜱的完全抗原混合液。所述完全抗原是由OVA分别偶联三唑磷、对硫磷、毒死蜱的半抗原得到。本专利技术对所述偶联方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的偶联方案即可。在本专利技术中，所述抗原溶液添加到酶标板中的体积优选为50～120μL，更优选为100μL。所述包被的温度优选为2～6℃，更优选为4℃。所述包被的时间优选为6～18h，更优选为8～12h。所述洗板用溶液为洗液。所述洗液优选为含有吐温-20的PBS缓冲液，所述吐温-20的体积浓度优选为0.1～1％，更优选为0.3～0.7％，最优选为0.5％；所述PBS缓冲液的摩尔浓度优选为0.005～0.015mol/L，更优选为0.01mol/L。第一次洗板的目的是洗去未与酶标板结合的抗原。所述洗液在第一次洗板中的用量优选为280～320μL/孔，更优选为300μL/孔。所述洗板的次数优选为2～4次，更优选为3次。在本专利技术中，所述封闭的温度优选为30～40℃，更优选为37℃。所述封闭的时间优选为0.5～2h，更优选为1h。在本专利技术中，所述封闭液优选为含有BSA的PBS缓冲液，所述BSA的质量浓度优选为1～3％，更优选为2％。所述PBS缓冲液的浓度优选为0.005～0.015mol/L，更优选为0.01mol/L。所述封闭液的添加量优选为200～350μL，更优选为300μL。第二次洗板的目的是去除酶标板中的封闭液，所述洗液在第二次洗板中的用量优选为280～320μL/孔，更优选为300μL/孔。所述洗板的次数优选为2～4次，更优选为3次。在本专利技术中，所述包被在黑色酶标板中的抗原与农药标准品或待测样品中的有机磷农药残留竞争结合特异性抗体。本专利技术提供的免疫分析试剂盒包括胶体金探针溶液。在本专利技术中，所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和以下任意一种特异性单克隆抗体的金纳米粒子；所述特异性单克隆抗体包括三唑磷抗体、对硫磷抗体和毒死蜱抗体；所述生物条形码包括不同颜色荧光基团标记的生物条形码。修饰有相同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于荧光寡核苷酸信号放大技术检测有机磷农药多残留的免疫分析试剂盒，其特征在于，包括如下组成：包被有抗原的黑色酶标板、胶体金探针溶液、洗液和二硫苏糖醇溶液；所述抗原包括三唑磷、对硫磷和毒死蜱；所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和以下任意一种特异性单克隆抗体的金纳米粒子；所述特异性单克隆抗体包括三唑磷抗体、对硫磷抗体和毒死蜱抗体；所述金纳米粒子表面修饰生物条形码的数量为130～170条；所述生物条形码标记有荧光基团；修饰有相同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被同一颜色的荧光基团标记；修饰有不同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被不同颜色的荧光基团标记。

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光寡核苷酸信号放大技术检测有机磷农药多残留的免疫分析试剂盒，其特征在于，包括如下组成：包被有抗原的黑色酶标板、胶体金探针溶液、洗液和二硫苏糖醇溶液；所述抗原包括三唑磷、对硫磷和毒死蜱；所述胶体金探针为表面修饰有生物条形码和以下任意一种特异性单克隆抗体的金纳米粒子；所述特异性单克隆抗体包括三唑磷抗体、对硫磷抗体和毒死蜱抗体；所述金纳米粒子表面修饰生物条形码的数量为130～170条；所述生物条形码标记有荧光基团；修饰有相同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被同一颜色的荧光基团标记；修饰有不同单克隆抗体的金纳米粒子表面对应修饰的生物条形码被不同颜色的荧光基团标记。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述三唑磷的包被浓度为0.12～0.2mg/L，所述对硫磷的包被浓度为0.56～0.7mg/L，所述毒死蜱的包被浓度为0.8～0.94mg/L。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述胶体金探针溶液的摩尔浓度为8～10nmol/L；所述金纳米粒子的粒径为12～14nm。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗液含有体积分数0....

【专利技术属性】
技术研发人员：金茂俊，王静，张婵，杜鹏飞，佘永新，金芬，邵华，郑鹭飞，王珊珊，王淼，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11