一种基于GD2的嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基于GD2嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域和自毁结构域串联而成；其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原为GD2，所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原GD2的单链抗体，所述自毁结构域为胱天蛋白酶9结构域。本发明专利技术的嵌合抗原受体实际应用于表达肿瘤特异靶点GD2的IV期神经母细胞瘤病人中，有更小的临床副作用与更高的安全性，可有效缩小实体瘤灶，并于病人体内长期监测到GD2‑CART的存在，有效延长病人整体生存率。

【技术实现步骤摘要】
一种基于GD2的嵌合抗原受体及其应用
本专利技术涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种基于GD2的嵌合抗原受体及其应用，具体为以肿瘤特异靶点GD2为基础的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用。
技术介绍
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(ChimericantigenreceptorT-cellimmunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。通常，CAR包含抗体的单链片段可变(Singlechainfragmentvariable，scFv)区或对肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigen,TAA)具有特异性的结合结构域，其通过铰链和跨膜区与T细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞活化部分包括与T细胞效应物功能触发(例如CD3ζ)部分串联的T细胞共刺激结构域。CAR介导的过继性免疫疗法允许CAR-移植的T细胞以非HLA限制性方式直接识别靶肿瘤细胞上的TAA。神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体恶性肿瘤，其中有50％的病童被发先有肿瘤大规模的扩散与转移，常规的手术、化疗、放疗与自体干细胞移植对于这群病人的治疗效果有限，即使在控制病情达到缓解后也有80％以上的病人会于一年内复发并且死亡。治疗这些患者的一种方法是通过CAR的表达，对T细胞进行遗传修饰以靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。CAR是经设计以人白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)非依赖性方式识别细胞表面抗原的抗原受体。尝试使用表达CAR的遗传修饰细胞来治疗这些类型的患者已经取得了有前景的成功。GD2广泛地表现在神经母细胞瘤、黑色素瘤等肿瘤当中，在正常组织中低量且局限性地表达，是一免疫治疗理想的肿瘤抗原，目前在神经母细胞瘤的免疫治疗中，发展较为成熟的有针对GD2的抗体治疗，此一方式在临床上取得初步的成功，但抗体治疗的问题在于，抗体施打后存在于外围血当中较难精准地进入肿瘤组织或肿瘤微小残留的部位，且抗体施打后无法长期存在体内，而此抗GD2抗体为人源-鼠源嵌合的抗体结构，势必会使人体对其产生抗性，增加了再治疗的困难性。CN106536563A公开了包含双唾液酸神经节苷脂(GD2)结合域的嵌合抗原受体(CAR)，所述GD2结合域包含a)具有互补决定区(CDR)的重链可变区；b)具有CDR的轻链可变区；及表达此类CAR的T细胞在一些癌症的治疗中的作用；该专利中的嵌合抗原受体与GD2的结合效果有待提高，其免疫效果也可以进一步提高。因此，制备一种完全人源化的嵌合抗原受体GD2-CART细胞，除了俱有抗体治疗的优点，且因为T细胞本身的特性，可精准地进入肿瘤组织，并长期的存在于体内，必能提供复发难治的神经母细胞瘤一个更有效的治疗选择。
技术实现思路
针对目前CAR-T技术治疗肿瘤中靶向不十分理想，以及肿瘤微环境影响CAR-T技术治疗效果的情况，本专利技术提供一种基于GD2的嵌合抗原受体及其应用，本专利技术制备的嵌合抗原受体通过将GD2-CAR-T进行基因改造，从而提高了靶点的免疫长效性与安全性，增强了CAR-T细胞的治疗效果。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种基于GD2的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域和自毁结构域串联而成；其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原为GD2，所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原GD2的单链抗体，所述肿瘤表面抗原GD2的单链抗体的氨基酸序列选自：(a)如SEQIDNO.1-3所示的氨基酸序列；或者，(b)如SEQIDNO.1-3所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合GD2和诱导T细胞信号传导功能的氨基酸序列。本专利技术中，通过对抗原结合结构域的单链抗体与CAR的基因结构进行特定的改造，从而使得基因修改过后的CAR-T细胞能够特异的结合在肿瘤的GD抗原上，获得相对比较适度的信号刺激，发挥有效的杀伤作用，同时缓慢释放免疫因子，降低免疫因子风暴危险，相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果与安全性。所述针对肿瘤表面抗原GD2的单链抗体氨基酸序列(SEQIDNO.1-3)如下：SEQIDNO.1所示的氨基酸序列：HPAFLLIPQVQLVESGPGVVQPGRSLRISCAVSGFSVTNYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGITNYNSAFMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCASRGGHYGYALDYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKPGSSEGSTKGEIVMTQTPATLSVSAGERVTITCKASQSVSNDVTWYQQKPGQAPRLLIYSASNRYSGVPARFSGSGYGTEFTFTISSVQSEDFAVYFCQQDYSSFGQGTKLEIK；SEQIDNO.2所示的氨基酸序列：EVQLVQSGAEVEKPGASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMHLKSLRSEDTAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSGSTSGSGKPGSSEGSTKGDVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELK；SEQIDNO.3所示的氨基酸序列：AFLLIPEVKLVESGGGLVLPGDSLRLSCATSEFTFTDYYMTWVRQPPRKALEWLGFIRNRANGYTTEYNPSVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRTEDSATYYCARVSNWAFDYWGQGTTLTVSSGSTSGSGKPGSSEGSTKGDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLLKNNGNTFLHWYLQKSGQSPKLLIYKVSNRLSGVPDRFSGSGSGTYFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPYTFGGGTKLEIK.本专利技术中，所述针对肿瘤表面抗原GD2的CAR信号结构进行了特异性改造，也能快速与不同的GD2单链抗体进行改造，使得改造后的CAR表达出来的免疫刺激力更强。根据本专利技术，所述如SEQIDNO.1-3所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的氨基酸序列与SEQIDNO.1-3所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，优选为95％同一性的氨基酸序列，所述改造后的氨基酸序列仍然能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合GD2和诱导T细胞信号传导功能。所述90％同一性例如可以是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。根据本专利技术，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域(CD28细胞膜外和CD28细胞膜传导结构域)和/或CD8α跨膜结构域，在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于GD2嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域和自毁结构域串联而成；其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原为GD2，所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原GD2的单链抗体，所述肿瘤表面抗原GD2的单链抗体的氨基酸序列选自：(a)如SEQ ID NO.1‑3所示的氨基酸序列；或者，(b)如SEQ ID NO.1‑3所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合GD2和诱导T细胞信号传导功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种基于GD2嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域和自毁结构域串联而成；其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原为GD2，所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原GD2的单链抗体，所述肿瘤表面抗原GD2的单链抗体的氨基酸序列选自：(a)如SEQIDNO.1-3所示的氨基酸序列；或者，(b)如SEQIDNO.1-3所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合GD2和诱导T细胞信号传导功能的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述如SEQIDNO.1-3所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的氨基酸序列与SEQIDNO.1-3所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，优选为95％同一性的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域；优选地，所述共刺激信号传导结构域为CD28信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域的组合；优选地，所述共刺激信号传导结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，，所述自毁结构域为包含胱天蛋白酶9结构域；优选地，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示；优选地，所述自毁结构域通过2A序列与CD3ζ信号传导结构域相串联。5.根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和...

【专利技术属性】
技术研发人员：李昱琛，
申请(专利权)人：北京美康基免生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11