一种CD105单链抗体-ES融合蛋白的制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及靶向抗体内皮抑素融合蛋白制备技术领域，具体涉及本技术方案提供一种CD105单链抗体‑ES融合蛋白，融合蛋白由CD105单链抗体和ES组成，CD105单链抗体‑ES融合蛋白。CD105单链抗体和ES氨基酸序列分别如序列表中1和2所示。有益效果：本技术方案以肿瘤组织中的CD105为靶点，将抗CD105单链抗体与ES构成融合蛋白scFV(CD105)‑ES，使ES获得靶向递送特性，能够一定程度上解决用药量大和半衰期短的问题，提高ES的疗效。

【技术实现步骤摘要】
一种CD105单链抗体-ES融合蛋白的制备方法和用途
本专利技术属于靶向抗体内皮抑素融合蛋白制备
，具体涉及一种CD105单链抗体-ES融合蛋白的制备方法和用途。
技术介绍
血管内皮抑制素(Endostatin，简称内皮抑素或ES)是1997年O′Reilly等从培养的小鼠内皮细胞瘤(EOMA)上清中分离纯化的一种内源性血管生成抑制剂，为20kd分子量蛋白质。氨基酸序列分析显示：内皮抑素(ES)是胶原18的降解产物，具体为胶原18分子C端部分，共184个氨基酸。进一步晶体结构分析发现：ES结构表面有一个由11个精氨酸残基组成的碱性区域，为肝素结合位点，这解释了ES对肝素的高亲和力特性，也可能是通过该区域与血管生成因子竞争结合肝素，起到抑制血管生成作用。但也有研究表明ES与血管壁的结合不依赖于肝素结合位点，且与FGF-2无竞争性抑制作用。通过基因修饰方法去除锌离子结合位点的研究表明，ES抑制内皮细胞的迁移及肿瘤的生长并不依赖锌离子结合位点。通过多个研究和实验显示，ES对血管内皮细胞、血管生成和肿瘤生长和转移都有抑制作用，且无耐药性和明显毒副作用，为肿瘤的临床治疗开辟了一条新路。随着ES作用机制的完全阐明，如何延长ES在患者体内半衰期，选择安全高效的合适载体来进行基因治疗等这问题将是接下来该领域的研究热点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供的一种CD105单链抗体-ES融合蛋白，及其制备方法和用途。为解决上述技术问题，本技术方案提供一种CD105单链抗体-ES融合蛋白，融合蛋白由CD105单链抗体和ES组成。进一步地，CD105单链抗体-ES融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：CD105单链抗体和ES氨基酸序列分别如序列表中1和2所示；或与序列表中1和2所示的氨基酸序列同源性在80％-100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或序列表中1和2所示的氨基酸序列经增加、缺失或者替换一个或多个氨基酸具有同等活性的衍生的蛋白。进一步地，CD105单链抗体-ES融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：1)CD105单链抗体-ES融合蛋白表达载体pET28a-antiCD105-ES的构建；2)将1)中构建表达载体转化至菌株BL21DE3，获得转基因重组菌；3)CD105单链抗体-ES融合蛋白的诱导表达及纯化：对CD105单链抗体-ES融合蛋白用1mMIPTG诱导4小时，收集菌液进行超声破碎，离心后收集沉淀，用8M尿素变性剂溶解沉淀，并依次在6M、4M、2M、0M尿素溶液中透析复性，CD105单链抗体-ES融合蛋白经AKTAPurifier900FPLC系统，镍离子亲和层析柱纯化：用SDS-PAGE方法检测目的蛋白。进一步地，表达CD105单链抗体-ES融合蛋白转的基因重组菌，包含pET28a-antiCD105-ES表达载体。进一步地，纯化分离得到的CD105单链抗体-ES融合蛋白可作为抗肿瘤药物的应用。采用了上述技术方案后，本专利技术的有益效果是：靶向给药能有效克服ES在临床治疗中存在用药量大和体内半衰期短等缺点。CD105是新生血管标志物，在血管丰富的实体瘤中高表达，在癌旁正常组织几乎不表达，具有较好的肿瘤组织特异性。单链抗体(scFV)具有非特异性反应低，分子小易于渗透，可大量生产等优点；抗CD105单链抗体具有较好的肿瘤组织靶向性。本技术方案以肿瘤组织中的CD105为靶点，将抗CD105单链抗体与ES构成融合蛋白CD105单链抗体-ES，使ES获得靶向递送特性，能够一定程度上解决用药量大和半衰期短的问题，提高ES的疗效。构建融合蛋白的表达载体，转化后得到表达融合蛋白的工程菌中。纯化融合蛋白后，给药鸡胚，比较实验组CD105单链抗体-ES融合蛋白与空白对照组结果显示，CD105单链抗体-ES融合蛋白对鸡胚血管形成有显著抑制效果。相关研究结果将为该靶向治疗方法应用于临床奠定基础。附图说明图1表示CD105-ES阳性菌株全菌蛋白SDS-PAGE电泳图。泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)；泳道1：宿主菌全菌蛋白；泳道2：IPTG诱导全菌蛋白(箭头所指为重组蛋白)。图2表示CD105-ES阳性菌株破碎上清及沉淀SDS-PAGE电泳图。泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)；泳道1：37℃诱导表达破碎后的上清蛋白；泳道2：37℃诱导表达破碎后的不溶蛋白(箭头所指为重组蛋白)。图3表示CD105-ES阳性菌株破碎上清及沉淀分别在16℃和30℃SDS-PAGE电泳图。泳道M：蛋白分子量标准(116.0/66.2/45.0/35.0/25.0/18.4/14.4kDa)；泳道1：16℃诱导表达破碎后的上清蛋白；泳道2：16℃诱导表达破碎后的不溶蛋白；泳道3：30℃诱导表达破碎后的上清蛋白；泳道4：30℃诱导表达破碎后的不溶蛋白(箭头所指为重组蛋白)。图4表示CD105单链抗体-ES融合蛋白抑制鸡胚血管生成实验结果图(A：PBS处理，空白对照组)。图5表示CD105单链抗体-ES融合蛋白抑制鸡胚血管生成实验结果图(50mMScFV-ES融合蛋白处理)。具体实施方式下面结合附图1至5和具体实施例对本专利技术进行详细描述，但不作为对本专利技术的限定。实施例一本技术方案提供一种CD105单链抗体-ES融合蛋白，融合蛋白由CD105单链抗体和ES连接组成。CD105单链抗体-ES融合蛋白，所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：CD105单链抗体和ES的氨基酸序列分别如序列表中1和2所示；或与序列表中1和2所示的氨基酸序列同源性在80％-100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或序列表中1和2所示的氨基酸序列经增加、缺失或者替换一个或多个氨基酸具有同等活性的衍生的蛋白。实施例二在实施例一的基础上，CD105单链抗体-ES融合蛋白的表达和纯化过程如下：1.表达载体pET28a-antiCD105-ES的构建：ES基因两端加上NcoI、HindIII酶切位点序列，并委托由上海吉玛制药技术有限公司进行化学合成并克隆至pGLV-H1-GFP+Puro，得到克隆载体pGLV-H1-GFP+Puro-ES。pET28a-antiCD105(广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室保存)进行NcoI和HindIII核酸酶酶切后进行核酸电泳，切胶纯化得到含有CD105单链抗体基因的线性载体；pGLV-H1-GFP+Puro-ES通过进行NcoI和HindIII核酸酶酶切后进行核酸电泳，切胶纯化得ES基因；pET28a-antiCD105和pGLV-H1-GFP+Puro-ES的切胶纯化产物进行连接，中得到的连接产物转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，涂布Kan抗性平板进行筛选，通过对菌液PCR和测序筛选序列符合要求的质粒，即获得CD105单链抗体-ES融合蛋白基因克隆载体pET28a-antiCD105-ES。2.将表达载体pET28a-antiCD105-ES转化至表达菌株BL21DE3：取已经确认的100ng/μL表达载体pET28a-antiCD105-ES0.1μL至5μL转化入氯化钙制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CD105单链抗体‑ES融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包括CD105单链抗体和ES。

【技术特征摘要】
1.一种CD105单链抗体-ES融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包括CD105单链抗体和ES。2.根据权利要求1所述的CD105单链抗体-ES融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白具有如下氨基酸序列：CD105单链抗体和ES氨基酸序列分别如序列表中1和2所示；或与序列表中1和2所示的氨基酸序列同源性在80％-100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或序列表中1和2所示的氨基酸序列经增加、缺失或者替换一个或多个氨基酸具有同等活性的衍生的蛋白。3.一种权利要求1所述CD105单链抗体-ES融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)CD105单链抗体-ES融合蛋白表达载体pET28a-antiCD105-E...

【专利技术属性】
技术研发人员：舒伟，刘恒，李东明，朱兰玉，李福记，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西,45