受试物致敏性检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及受试物致敏性检测方法及其试剂盒。该检测方法包括：取若干小鼠，随机分组；测量每组各小鼠的双耳厚度；进入第一时间段；在第一时间段内，每天在每组各小鼠的双耳耳部涂抹等量试剂；进入第二时间段；在第二时间段结束时，针对每组各小鼠，先测量小鼠的双耳厚度，再处死小鼠并于无菌条件下取小鼠双侧耳后淋巴结并制成细胞悬液，向细胞悬液加入5‑溴脱氧尿嘧啶核苷溶液并作培养，然后采用ELISA法测定5‑溴脱氧尿嘧啶核苷的含量；按限定标准判断受试物致敏性。本发明专利技术能鉴定受试物是否致敏性阳性，不需对动物腹腔注射以减轻动物痛苦；5‑溴脱氧尿嘧啶核苷用量大幅减少，利于降低检测成本。

【技术实现步骤摘要】
受试物致敏性检测方法及其试剂盒
本专利技术涉及一种受试物致敏性检测方法及其试剂盒，属于医学检测

技术介绍
据专利技术人所知，致敏性的外源化学物刺激机体时，机体易产生过敏反应，而判断化学物是否具有致敏性，就需要通过动物试验来检测。目前常用的检测方法采用向动物腹腔注射受试物的方式，但是这会让动物产生痛苦，不符合动物福利“3R”原则。同时，该检测方法中会用到价格较贵的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(即BrdU)，每只鼠的用量达5mg，而一次检测试验每组最低使用20只小鼠，也即每组需要至少100mg的BrdU，使整个检测成本居高不下。亟待研发减轻动物痛苦以符合动物福利“3R”原则、且降低检测成本的检测方法。经检索发现，以申请号CN201711285287.7、申请公布号CN107966562A、名称《一种重组柯萨奇病毒B3注射液致敏性的检测评价方法》的中国专利技术专利申请为代表的现有技术中，并没有给出解决上述技术问题的技术手段或技术教导。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种受试物致敏性检测方法，能鉴定受试物是否致敏性阳性，不需对动物腹腔注射以减轻动物痛苦，5-溴脱氧尿嘧啶核苷(即BrdU)用量大幅减少，利于降低检测成本。同时，本专利技术还提供与该检测方法相配的试剂盒。本专利技术解决其技术问题的技术方案如下：受试物致敏性检测方法，其特征是，包括以下步骤：第一步、取若干小鼠，随机分成阴性对照组、阳性对照组、以及至少两个受试组；每组小鼠数量相等，每组小鼠的数量为至少4只；第二步、测量每组各小鼠的双耳厚度；第三步、进入第一时间段；在第一时间段内，每天在每组各小鼠的双耳耳部涂抹等量试剂；阴性对照组涂抹的试剂为溶剂，阳性对照组涂抹的试剂为阳性对照物，各受试组涂抹的试剂为不同浓度的受试物；所述第一时间段为至少3天；第四步、进入第二时间段，所述第二时间段为至少2天；在第二时间段结束时，针对每组各小鼠，先测量小鼠的双耳厚度，再处死小鼠并于无菌条件下取小鼠双侧耳后淋巴结并制成细胞悬液，向细胞悬液加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液并作培养，然后采用ELISA法测定5-溴脱氧尿嘧啶核苷的含量；第五步、针对阳性对照组和各受试组，计算每组的刺激性指标和致敏性指标；其中，刺激性指标为耳厚差百分比，且耳厚差百分比按下式计算：致敏性指标为SI3，且SI3按下式计算：式中，BrdU为5-溴脱氧尿嘧啶核苷；对于阳性对照组，如果刺激性指标小于或等于25％，且致敏性指标大于或等于1.6并小于14，则本次检测的试验系统可靠；对于各受试组，只要有一个受试组的致敏性指标大于或等于1.6、且刺激性指标小于或等于25％，则该受试物致敏性为阳性。该检测方法基于以下原理：致敏性的外源化学物刺激机体时，可引起局部引流淋巴结淋巴细胞增殖，可以通过局部引流淋巴结淋巴细胞增殖情况来判断受试物致敏性。在该检测方法中，只需在小鼠双耳耳部涂抹试剂，不需要腹腔注射，从而大大减轻动物的痛苦，更加符合动物福利“3R”原则；完成全部检测过程最短仅需1周左右；所需动物数量大为减少，每组最低仅需4只动物；此外，由于仅需向细胞悬液中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(即BrdU)，这就能大幅降低BrdU的用量，利于降低成本。本专利技术进一步完善的技术方案如下：优选地，第四步还包括：取小鼠双侧耳后淋巴结后称重并记作淋巴结重量，获得细胞悬液后进行计数并记作淋巴细胞数；第五步还包括：针对阳性对照组和各受试组，计算每组的辅助指标，所述辅助指标为SI1或SI2，且SI1、SI2分别按下式计算：当受试物致敏性为阳性时，各受试组中至少有一个受试组的辅助指标大于或等于1.6。采用该优选方案后，可采用辅助指标来印证致敏性指标的判断结果。优选地，第五步还包括：针对5-溴脱氧尿嘧啶核苷含量做统计分析，观察各受试组是否与阴性对照组存在显著差异；对于各受试组，当该受试组与阴性对照组存在显著差异时，若该受试组的致敏性指标小于或等于1.9，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为有刺激性，若该受试组的致敏性指标大于1.9，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为既有刺激性也有致敏性；当该受试组与阴性对照组无显著差异时，若该受试组的致敏性指标小于1.6，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为非刺激非致敏，若该受试组的致敏性指标大于或等于1.6时，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为有致敏性。当受试物的各分级评价中含有致敏性时，按下式计算受试物的EC1.6：上式中，a为致敏性指数高于1.6的受试物最低浓度，b为与a对应的致敏性指数，c为致敏性指数低于1.6的受试物最高浓度，d为与c对应的致敏性指数；若EC1.6大于10，则受试物的致敏强度等级为弱致敏物，若EC1.6大于或等于1、且小于或等于10，则受试物的致敏强度等级为中强致敏物，若EC1.6大于或等于0.1、且小于或等于1，则受试物的致敏强度等级为强致敏物，若EC1.6小于0.1，则受试物的致敏强度等级为极强致敏物。采用以上优选方案后，可对受试物进行更为细致地鉴别。优选地，第四步中，将小鼠双侧耳后淋巴结制成细胞悬液的具体过程为：U1、先将小鼠双侧耳后淋巴结经200目筛网研磨，再用PBS溶液清洗细胞，将所得细胞混合液转移到预设体积的培养液中，混匀，即得细胞悬液；第四步中，向细胞悬液加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液并作培养的具体过程为：U2、将细胞悬液加入孔板，每只小鼠至少3个平行孔，每孔加入的细胞悬液体积相等；向各孔细胞悬液中分别加入等体积的5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液，培养18-36小时；第四步中，采用ELISA法测定5-溴脱氧尿嘧啶核苷含量的具体过程为：U3、将孔板离心后弃上清，并吹干孔板各孔；每孔加入固定液进行固定，然后离心弃液体；每孔加入抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷抗体溶液并孵育，然后离心弃液体；每孔加入洗涤液进行清洗，然后离心弃液体；每孔加入TMB底物溶液并避光孵育，然后以酶标仪测定吸光度值后计算5-溴脱氧尿嘧啶核苷的含量。更优选地，U2中，每孔加入的5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液体积为25μl，5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液的浓度为150μg/ml。更优选地，U1中，所述培养液为含胎牛血清的1640培养液，所述预设体积为15ml；U2中，所述孔板为平底96孔板，每孔加入的细胞悬液体积为100μl，培养条件为置37℃5％CO2细胞培养箱中培养；U3中，离心条件分别为300g×10min，吹干时间为15min，每孔加入固定液的体积为200μl、固定温度为15℃-35℃、且固定时间为30min，固定液为甲醇-冰乙酸混合液，每孔加入抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷抗体溶液的体积为200μl、孵育温度为15℃-35℃、且孵育时间为1小时，每孔加入洗涤液体积为200μl、且清洗次数为3次，洗涤液为磷酸盐缓冲液，每孔加入TMB底物溶液的体积为100μl、孵育温度为15℃-35℃、且孵育时间为15min，测定吸光度值时的参考波长为450nm。采用以上优选方案后，可以更好地实施检测过程。优选地，第二步还包括记录每组各小鼠的体重；在第三步的第一时间段内、以及第四步的第二时间段内，每天记录每组各小鼠的体重；第四步还包括在第二时间段结束时记录每组各小鼠的体重；第五步还包括针对小鼠体重做统计分析，观察在各时间点阳性对照组、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.受试物致敏性检测方法，其特征是，包括以下步骤：第一步、取若干小鼠，随机分成阴性对照组、阳性对照组、以及至少两个受试组；每组小鼠数量相等，每组小鼠的数量为至少4只；第二步、测量每组各小鼠的双耳厚度；第三步、进入第一时间段；在第一时间段内，每天在每组各小鼠的双耳耳部涂抹等量试剂；阴性对照组涂抹的试剂为溶剂，阳性对照组涂抹的试剂为阳性对照物，各受试组涂抹的试剂为不同浓度的受试物；所述第一时间段为至少3天；第四步、进入第二时间段，所述第二时间段为至少2天；在第二时间段结束时，针对每组各小鼠，先测量小鼠的双耳厚度，再处死小鼠并于无菌条件下取小鼠双侧耳后淋巴结并制成细胞悬液，向细胞悬液加入5‑溴脱氧尿嘧啶核苷溶液并作培养，然后采用ELISA法测定5‑溴脱氧尿嘧啶核苷的含量；第五步、针对阳性对照组和各受试组，计算每组的刺激性指标和致敏性指标；其中，刺激性指标为耳厚差百分比，且耳厚差百分比按下式计算：

【技术特征摘要】
1.受试物致敏性检测方法，其特征是，包括以下步骤：第一步、取若干小鼠，随机分成阴性对照组、阳性对照组、以及至少两个受试组；每组小鼠数量相等，每组小鼠的数量为至少4只；第二步、测量每组各小鼠的双耳厚度；第三步、进入第一时间段；在第一时间段内，每天在每组各小鼠的双耳耳部涂抹等量试剂；阴性对照组涂抹的试剂为溶剂，阳性对照组涂抹的试剂为阳性对照物，各受试组涂抹的试剂为不同浓度的受试物；所述第一时间段为至少3天；第四步、进入第二时间段，所述第二时间段为至少2天；在第二时间段结束时，针对每组各小鼠，先测量小鼠的双耳厚度，再处死小鼠并于无菌条件下取小鼠双侧耳后淋巴结并制成细胞悬液，向细胞悬液加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷溶液并作培养，然后采用ELISA法测定5-溴脱氧尿嘧啶核苷的含量；第五步、针对阳性对照组和各受试组，计算每组的刺激性指标和致敏性指标；其中，刺激性指标为耳厚差百分比，且耳厚差百分比按下式计算：致敏性指标为SI3，且SI3按下式计算：式中，BrdU为5-溴脱氧尿嘧啶核苷；对于阳性对照组，如果刺激性指标小于或等于25％，且致敏性指标大于或等于1.6并小于14，则本次检测的试验系统可靠；对于各受试组，只要有一个受试组的致敏性指标大于或等于1.6、且刺激性指标小于或等于25％，则该受试物致敏性为阳性。2.根据权利要求1所述的受试物致敏性检测方法，其特征是，第四步还包括：取小鼠双侧耳后淋巴结后称重并记作淋巴结重量，获得细胞悬液后进行计数并记作淋巴细胞数；第五步还包括：针对阳性对照组和各受试组，计算每组的辅助指标，所述辅助指标为SI1或SI2，且SI1、SI2分别按下式计算：当受试物致敏性为阳性时，各受试组中至少有一个受试组的辅助指标大于或等于1.6。3.根据权利要求1所述的受试物致敏性检测方法，其特征是，第五步还包括：针对5-溴脱氧尿嘧啶核苷含量做统计分析，观察各受试组是否与阴性对照组存在显著差异；对于各受试组，当该受试组与阴性对照组存在显著差异时，若该受试组的致敏性指标小于或等于1.9，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为有刺激性，若该受试组的致敏性指标大于1.9，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为既有刺激性也有致敏性；当该受试组与阴性对照组无显著差异时，若该受试组的致敏性指标小于1.6，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为非刺激非致敏，若该受试组的致敏性指标大于或等于1.6时，则在该受试组浓度下，受试物的分级评价为有致敏性。4.根据权利要求3所述的受试物致敏性检测方法，其特征是，当受试物的各分级评价中含有致敏性时，按下式计算受试物的EC1.6：上式中，a为致敏性指数高于1.6的受试物最低浓度，b为与a对应的致敏性指数，c为致敏性指数低于1.6的受试物最高浓度，d为与c对应的致敏性指数；若EC1.6大于10，则受试物的致敏强度等级为弱致敏物，若EC1.6大于或等于1、且小于或等于10，则受试物的致敏强度等级为中强致敏物，若EC1.6大于或等于0.1、且小于或等于1，则受试物的致敏强度等级为强致敏物，若EC1.6小于0.1，则受试物的致敏强...

【专利技术属性】
技术研发人员：环飞，程洁，秦珩，靳苏香，王玉邦，张静姝，严婷，张成香，李世芬，王军，董昊，张璐璐，胡艳辉，钱雯，章婉，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32