本发明专利技术涉及一种单克隆抗体ＳＰＡ红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的间接法。该方法首先配制一抗、二抗致敏红细胞保存液，其次分离外周血淋巴细胞，再用含２０％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液悬浮制得二抗致敏红细胞应用液和一抗致敏淋巴细胞悬液；然后将一抗致敏淋巴细胞悬液与二抗致敏红细胞应用液以１∶１的体积比混合成混合悬液，在１８～２８℃下静置后离心，再在４℃静置１５～４５ｍｉｎ；最后用带吸头的移液器吹吸混合悬液８～１５次后推制成细胞涂片，经自然干燥、染色后用高倍镜计数。本发明专利技术与原ＭｃＡｂ－Ａ－Ｅ间接法相比具有检验过程简化、周期短、可量化控制、满足临床检验要求的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学免疫学，尤其涉及一种单克隆抗体SPA红细胞花环法检 测淋巴细胞亚群的间接法。
技术介绍
随着分子免疫学的发展，根据淋巴细胞膜表面分化抗原群(cluster of differentiation, CD)的不同，可将T、 B、 NK淋巴细胞分成若干亚群， 临床实验室通过抗分化抗原抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD20、 抗CD16、抗CD56等的单克隆抗体(McAb)，对外周血淋巴细胞进行检验， 依据其阳性率判定总T细胞、T辅助性细胞(Th)、细胞毒性T细胞(Tc)亚 群、B淋巴细胞、NK细胞等的分布和变化，从而判断人体的免疫功能，达到 预防保健和疾病的诊断、治疗、预后的目的。目前，淋巴细胞亚群常用的检验方法有流式细胞仪法、免疫荧光法、 AP-AAP桥联酶免疫法和SPA (金黄色葡萄球菌A蛋白)花环法。其中SPA 花环法又分红细胞花环法和菌花环法，而红细胞花环法又分直接法和间接法。SPA红细胞花环法的间接法因为应用单克隆抗体(McAb)，又叫单克隆 抗体SPA红细胞花环法间接法，简称McAb-A-E间接法。该法在《全国临床 检验操作规程》(中华人民共和国卫生部医政司编，第二版，东南大学出版社， 1997: 381 384和第一版1991: 320-322)中仅有McAb-A-E法原理以及直接 法的摘要性论述，但无详尽操作方法，实际工作中按"冻干抗体致敏红细胞花环试剂使用说明书"规定的方法进行具体操作(l)将冻干二抗(羊或兔抗小鼠IgG)致敏红细胞花环试剂中加入pH值为7.0 7.4的无钙、镁汉克氏平 衡盐溶液(简称无钙、镁Hank'S液)或磷酸盐缓冲液(PBS)溶解；(2)将一 抗——冻干抗CD3、抗CD4、抗CD8单克隆抗体加入1.0 mL pH值为7.0~7.4 的无钙、镁Hank'S液或PBS溶解；(3)按常规法(分离细胞以2000 2500 rpm 离心20 30min，用无钙、镁Hank，S液洗涤2次，每次转速为1000~1500 rpm， 离心5 10min)用淋巴细胞分离液分离出外周血淋巴细胞，最后用含20%新 生小牛血清的无钙、镁Hank，S液配成500万/mL; (4)将试管呈20度角斜放，于37°。孵育45min，将细胞悬液取出置另一试管中，离心去上清并恢复原量 备用；(5)根据待检样品数取一定量溶解后的一抗，用pH值为7.0 7.4的无转、 镁Hank'S液稀释；根据待检样品数取一定量二抗(羊或兔抗小鼠IgG)致敏 红细胞花环试剂悬液，离心去上清，用含20%新生小牛血清的无钙、镁Hank，S 液悬浮，恢复至原量；(6)将待测淋巴细胞悬液与一抗等量混合(各25 50)iL)， 在4t:作用30min，然后用pH值为7.0~7.4的无钙、镁Hank'S液洗3次；(7) 一抗致敏淋巴细胞悬液与二抗致敏红细胞悬液等量混合(各25 50pL)，室温(22~25°C)下放置10min, 500rpm离心10min，室温下继续放置1小时，并 在4"C放置2小时或过夜；(8)轻轻悬浮后加入25pL梅-格氏染液(May Gruenwaid)室温染色10min后，离心去上清，再加50|aL的姬姆萨 染液(Glemsa液)染色30min (或单用Glemsa液染色)，当天或第二天看结 果均可；(9)结果检查及判定用高倍镜检査，淋巴细胞周围黏附有三个以上红 细胞即为花环阳性细胞，未黏附红细胞者为阴性细胞，黏附一、二个红细胞 者即除掉不计数统计，计数100-200个淋巴细胞，算出花环形成细胞的百分 率。虽然McAb-A-E间接法所采用的冻干抗体致敏红细胞花环试剂本身具有 特异性强、敏感、稳定性好、有效期长、使用方便、仅需普通光学显微镜即 可进行检验的特点，且实验结果可保存两周左右，十几年来被临床实验室和 相关研究单位广泛应用，但是McAb-A-E间接法作为一种临床检验方法却由 于存在检验步骤多、所需标本量相对较多、周期长、易造成被测细胞损伤和 丢失、个别重要步骤无量化控制指标、非特异花环鉴别困难而影响计数结果 等缺陷，无法适应临床上快速、准确的要求，使很多实验室，特别是临床实 验室接受困难，限制了该方法的推广应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题就是提供一种检验过程简化、检验周期短、 能够进行量化控制、满足临床检验要求的单克隆抗体SPA红细胞花环法检测 淋巴细胞亚群的间接法。为解决上述问题，本专利技术所述的一种单克隆抗体SPA红细胞花环法检测 淋巴细胞亚群的间接法，包括下述步骤(l)配制一抗保存液；(2) 配制二抗致敏红细胞保存液；(3) 分离外周血淋巴细胞后用pH值为7.0 7.4含20%新生小牛血清的无 钙、镁汉克氏平衡盐溶液配成400-600万/mL淋巴细胞悬液；(4) 将一抗保存液用10倍的pH值为7.0-7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶 液稀释，形成一抗应用液。(5) 取二抗致敏红细胞保存液，以300 500 rpm转速离心6 10min后去上 清，用pH值为7.0 7.4含20。/。新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液悬 浮，形成与所取二抗致敏红细胞保存液等量的二抗致敏红细胞应用液；(6) 将淋巴细胞悬液以1: 1的体积比与一抗应用液混合并在4'C下作用 30min;经pH值为7.0 7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液洗涤弃上清后，按 与淋巴细胞悬液1: 1的体积比加入pH值为7.0-7.4含20%新生小牛血清的 无钙、镁汉克氏平衡盐溶液形成一抗致敏淋巴细胞悬液；(7) 将一抗致敏淋巴细胞悬液与二抗致敏红细胞应用液以1: 1的体积比混 合，在18~28°(:下放置10min;以300~500rpm转速离心5min后在4。C静置 15 45miru(8) 用20或25jiL容积的带吸头的移液器吹吸混合悬液8~15次；取混合 悬液推制细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，然后用高倍镜计 数淋巴细胞周围黏附有三个以上红细胞即为花环阳性细胞，未黏附红细胞 者为阴性细胞，黏附一、二个红细胞者除掉不计；计数时，选取细胞涂片从 头至尾的2/6~4/6之间至少两处区域共计数200个细胞，算出花环形成细胞的 百分率。所述步骤(l)中的一抗保存液是通过将冻干一抗加入1.0 mL pH值为 7.0-7.4无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或磷酸盐缓冲液溶解而成的，其中所述冻 干一抗为冻干抗CD3、抗CD4、抗CD8单克隆抗体中的任意一种。所述步骤(2)中的二抗致敏红细胞保存液是通过将冻干二抗致敏红细胞花 环试剂加入0.5mL pH值为7.0~7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或磷酸盐缓 冲液溶解而成的，其中所述冻干二抗为羊或兔抗小鼠IgG。所述歩骤(3)中的分离外周血淋巴细胞是指将采用肝素或乙二胺四乙酸抗 凝剂抽取的静脉血，以l: 1~3的体积比加入pH值为7.0 7.4的无钙、镁汉 克氏平衡盐溶液，混匀后加在淋巴细胞分离液上，淋巴细胞分离液与稀释血 液的体积比为1: 1~3，在18 28。C温度下，以800 1200 rpm的转速离心15 20min;再取出单个核细胞，并对单个核细胞用pH值为7.0-7.4的无钙、 镁汉克氏平衡盐溶液洗涤，每次以300~500 rpm的转速离心6本文档来自技高网...
【技术保护点】
单克隆抗体ＳＰＡ红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的间接法，包括下述步骤：（１）配制一抗保存液；（２）配制二抗致敏红细胞保存液；（３）分离外周血淋巴细胞后用ｐＨ值为７．０～７．４含２０％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液配成４００～６００万／ｍＬ淋巴细胞悬液；（４）将一抗保存液用１０倍的ｐＨ值为７．０～７．４的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液稀释，形成一抗应用液。（５）取二抗致敏红细胞保存液，以３００～５００ｒｐｍ转速离心６～１０ｍｉｎ后去上清，用ｐＨ值为７．０～７．４含２０％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液悬浮，形成与所取二抗致敏红细胞保存液等量的二抗致敏红细胞应用液；（６）将淋巴细胞悬液以１∶１的体积比与一抗应用液混合并在４℃下作用３０ｍｉｎ；经ｐＨ值为７．０～７．４的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液洗涤弃上清后，按与淋巴细胞悬液１∶１的体积比加入ｐＨ值为７．０～７．４含２０％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液形成一抗致敏淋巴细胞悬液；（７）将一抗致敏淋巴细胞悬液与二抗致敏红细胞应用液以１∶１的体积比混合，在１８～２８℃下放置１０ｍｉｎ；以３００～５００ｒｐｍ转速离心５ｍｉｎ后在４℃静置１５～４５ｍｉｎ；（８）用２０或２５μＬ容积的带吸头的移液器吹吸混合悬液８～１５次；取混合悬液推制细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，然后用高倍镜计数：淋巴细胞周围黏附有三个以上红细胞即为花环阳性细胞，未黏附红细胞者为阴性细胞，黏附一、二个红细胞者除掉不计；计数时，选取细胞涂片从头至尾的２／６～４／６之间至少两处区域共计数２００个细胞，算出花环形成细胞的百分率。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚伯程，
申请(专利权)人：甘肃省医学科学研究院，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]
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