魔芋软腐病菌特异性序列及其检测引物和应用制造技术

本发明专利技术属于植物保护技术领域，公开了魔芋软腐病菌特异性序列及其检测引物和应用，所述的特异性序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，本发明专利技术提供的魔芋软腐菌的特异性检测靶标，较之申请日前的鉴定靶标，具备特异性好、稳定性强和灵敏度高的特点，对于有着较高的同源性魔芋软腐菌近缘种或亚种都能很好的区分，避免了假阳性的产生。可以精确检测到魔芋软腐菌的存在，为魔芋软腐病的田间检测，以及该病害的早期诊断等提供了很好的工具。

Specific Sequence of Konjac Soft Rot Fungus and Its Detection Primers and Application

The invention belongs to the field of plant protection technology, and discloses the specific sequence of Konjac soft rot fungus and its detection primers and applications. The nucleotide sequence of the specific sequence is shown in SEQ ID NO.1. The specific detection target of Konjac soft rot fungus provided by the invention has better specificity than the identification target before the application date. Because of its high stability and sensitivity, it can distinguish closely related species or subspecies of Konjac soft rot fungi with high homology and avoid false positive. It can accurately detect the existence of konjac soft rot fungus, and provide a good tool for the field detection of konjac soft rot disease and early diagnosis of the disease.

【技术实现步骤摘要】
魔芋软腐病菌特异性序列及其检测引物和应用
本专利技术属于植物保护
，具体涉及魔芋软腐病菌特异性序列及其检测引物和应用。
技术介绍
魔芋(Amorphophalluskonjac)是一种多年生草本植物，其球茎中含有丰富的葡甘聚糖，广泛用于食品、化学工程、医药、农业和石油等领域(Lietal.,2010)。中国是魔芋的主要生产国，种植面积约1.13×105公顷(吴金平等，2014)。随着我国魔芋种植和连作面积的增加，魔芋细菌性软腐病发生逐年加重，导致魔芋生产的巨大损失(Wuetal.,2010,2012)。据统计，一般魔芋软腐病可导致减产30％-50％，在一些种植区域产量减少80％以上，有时甚至绝收(张鑫等，2010；Wuetal.,2015)。因此，软腐病严重制约了魔芋产业的发展，成为产业规模化的重要瓶颈和限制因素。魔芋软腐病是一种细菌性病害，主要是由胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum，Pcc)侵染引起(王国馨等，1989)。Pcc除可侵染魔芋外，还可侵染马铃薯、香蕉、菠萝等多种作物，具有广泛的寄主范围(Yasuhara-Belletal.,2016)。魔芋软腐病菌广泛存在于土壤中，可通过根系的富集作用，使致病菌数量增加从而通过伤口达到致病效果(Wuetal.,2010)。目前，对于魔芋软腐病的防治，除选育健康的魔芋球茎之外，还没有其他有效的防治方法(Wuetal.,2011)，因此加强魔芋软腐病的早期诊断显得尤为重要。目前，常规PCR和实时定量PCR虽然已经应用到魔芋软腐病的检测上(马改转等，2009；Wuetal.,2011)，但是PCR检测技术需要特殊的仪器设备且检测成本较高，不适合在田间快速应用，且先前报道的检测魔芋软腐菌的特异性引物多是基于16SrDNA及UPR特异性引物(马改转等，2009；Kangetal.,2003；Wuetal.,2011)，但申请人发现，针对16SrDNA设计的引物，对于一些近缘种或亚种之间有着较高的同源性病菌，很难区分，尤其很难区分亚种；而UPR特异性引物扩增出来的目的序列，与其近缘种存在较高的同源性，如：与Pectobacteriumcarotovorumsubsp.odoriferum的同源性高达95％，与Pectobacteriumcarotovorum的同源性达到94％，会在检测过程中造成非特异性扩增，造成假阳性问题。因此，开发魔芋软腐病菌Pcc的特异性检测靶标并建立一种魔芋软腐病的快速检测技术显得尤为重要。生物信息学及测序技术的快速发展为魔芋软腐病菌的特异性检测提供了新思路。BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)是一种比较DNA序列之间的差异的程序(McGinnisandMadden,2004)。通过BLAST比对，进行基因组间的比较，可筛选出魔芋软腐病菌Pcc特异性基因作为检测靶标。环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新型的检测技术，它需要具有链置换活性的BstDNA聚合酶和一组四到六个特别设计的引物，这些引物特异性识别靶DNA上的六个区域，在60-65℃等温条件下，在1小时内，以高特异性、高灵敏度、高效率扩增DNA(Notomietal.,2000；Nagamineetal.,2001,2002；Tomotadaetal.,2003)；并且可以通过肉眼直接观察LAMP的扩增结果，阳性扩增将产生大量副产物焦磷酸根离子，其可以与溶液中的镁离子结合以形成焦磷酸镁的白色沉淀，阴性对照没有白色沉淀(Morietal.,2001)。此外，当SYBRGreenI添加到扩增产物中时，阳性扩增的颜色变为荧光绿色，阴性对照保持橙色(Tomotadaetal.,2003)。因此，LAMP作为一种成本低廉、操作简便、灵敏度高、特异性强、结果判断快速的检测方法，适用于魔芋软腐病的田间快速检测。本专利技术通过比较基因组学方法筛选魔芋软腐菌Pcc的特异性靶标，设计开发了具有较好特异性和高灵敏度的LAMP特异性检测引物；同时建立一种适用于田间的LAMP快速检测技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了魔芋软腐病菌特异性序列在制备魔芋软腐病菌检测试剂中的应用，所述的魔芋软腐病菌特异性序列为SEQIDNO.1所示。本专利技术的另一个目的在于提供了针对魔芋软腐病菌特异性序列设计的引物在制备魔芋软腐病菌检测试剂中的应用，所述的魔芋软腐病菌特异性序列为SEQIDNO.1所示。本专利技术还有一个目的在于提供了针对魔芋软腐病菌特异性序列设计的LAMP引物，所述的引物为：F3:GCACAAGCTTGACTGCATAC、B3:TGGCGAGTTGTCCCCATAG、FIP:CGCCGTATCGGCACAGAAGAAAGCTTGGCGTTTCTCTCTCA、BIP:GCCCTCATCTCGCTGGCAATCATGTGCTTCCGGCAACAC、LF:AGAAACGGGATGGGGTGG和LB:GCCATCGAGCGTAGCGAA。为了达到以上目的，本专利技术采取以下技术措施：魔芋软腐病菌特异性序列在制备魔芋软腐病菌检测试剂中的应用，所述的魔芋软腐病菌特异性序列为SEQIDNO.1所示，只要该序列应用于魔芋软腐病菌的检测，都属于本专利技术的保护内容。针对魔芋软腐病菌特异性序列设计的引物在制备魔芋软腐病菌检测试剂中的应用，所述的魔芋软腐病菌特异性序列为SEQIDNO.1所示。只要针对该序列设计的引物用于魔芋软腐病菌的检测，都属于本专利技术的保护内容。以上所述的应用中，优选的，针对该特异性序列设计的LAMP引物，所述的引物为：F3:GCACAAGCTTGACTGCATAC、B3:TGGCGAGTTGTCCCCATAG、FIP:CGCCGTATCGGCACAGAAGAAAGCTTGGCGTTTCTCTCTCA、BIP:GCCCTCATCTCGCTGGCAATCATGTGCTTCCGGCAACAC、LF:AGAAACGGGATGGGGTGG和LB:GCCATCGAGCGTAGCGAA。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1.本专利技术提供了魔芋软腐菌的特异性检测靶标，较之申请日前的鉴定靶标，该靶标具备特异好、稳定性强和灵敏度高的特点，对于有着较高的同源性魔芋软腐菌近缘种或亚种都能很好的区分，避免了假阳性的产生。2.针对魔芋软腐菌的特异性检测靶标设计了LAMP检测引物，由于LAMP引物的设计需要结合靶序列上的六个区域，可以精确检测到魔芋软腐菌的存在，可以检测到50fg/μl的Pcc基因组DNA，这为魔芋软腐病的田间检测，以及该病害的早期诊断等提供了很好的工具。3.提供了一种方便、高效的病原菌特异性检测靶标筛选的方案，只需要获得目标病原菌的全基因组或部分基因组序列就能完成靶标筛选，有效地解决了检测靶标单一、设计检测引物特异性不强的问题。附图说明：图1魔芋软腐菌LAMP检测引物特异性检测可视化图；其中泳道1-14：采自湖北宜昌的Pcc菌株，15-24：采自湖北恩施的Pcc菌株，25-56：Dickeyadadantii,P.carotovorumsubsp.actinidiae,P.carotovorumsubsp.Br本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SEQ ID NO.1所示核苷酸在制备魔芋软腐病菌检测试剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.SEQIDNO.1所示核苷酸在制备魔芋软腐病菌检测试剂中的应用。2.针对SEQIDNO.1所示核苷酸设计的引物在制备魔芋软腐病菌检测试剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，所述的引物为：F3:GCACAAGCTTGACTGCATAC、B3:TGGCGAGTTGTCCCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑露，孙苗苗，黄俊斌，刘浩，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42