用于提取游离DNA的试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及用于提取游离DNA的试剂盒和方法，更特别涉及用于提取血浆或血清中游离DNA的试剂盒和方法。本发明专利技术的试剂盒和方法通过其特定的试剂组合，以高提取效率、低提取下限和优良的稳定性实现了对样品中、特别是血浆或血清中游离DNA的可靠提取。

【技术实现步骤摘要】
用于提取游离DNA的试剂盒和方法
本专利技术属于生物医学检测领域，涉及核酸纯化技术，特别涉及用于提取游离DNA的试剂盒和方法，更特别涉及用于提取血浆或血清中游离DNA的试剂盒和方法。
技术介绍
游离DNA是指循环血中游离于细胞外的、部分降解了的机体内源性DNA。游离DNA大部分都是双链DNA分子，其片段长度远小于基因组DNA，集中在0.18～21kb之间。因为游离DNA在机体内的含量是机体健康状态的一个重要指标，对疾病的早期诊断、预后、检测都具有重要的意义，因此近年来人们对于游离DNA特性的研究越来越深入。这一切都对游离DNA的提取技术提出了更高的要求。在游离DNA的提取中，需要得到满足的原则一般有：1.保证核酸一级结构的完整性；2.将其他生物大分子的污染降到最低程度；3.应当尽量去除其他核酸分子如RNA；4.得到的核酸样品中不应当存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子，从而对下游的进一步处理不会带来不良的影响。大多数核酸提取方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸分离与纯化等几个主要步骤。每一个步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。细胞裂解可以通过机械作用、化学作用、酶作用的方式来实现。机械作用包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。化学作用包括在一定pH环境和变性条件(如加热、表面活性剂、强离子剂等)下使细胞破裂、蛋白质变性沉淀、核酸被释放到水相。酶作用主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶使细胞破裂、核酸释放。在核酸提取过程中，可以通过加入适当的酶使不需要的物质降解，以利于核酸的分离与纯化。如在裂解液中加入蛋白酶可以降解蛋白质，灭活核酸酶DNase和RNase。对核酸的分离与纯化而言，传统的酚-氯仿提取法成本较低，但是效率差、重复性差，更是有不可避免的毒性。硅胶柱法简便快捷、纯度较高，但是不适合较小的片段。目前常用的磁珠法能够自动化操作，也适用于小片段，但是提取纯度低、有盐分残留，也不适合微量提取。另外，目前游离DNA提取的试剂盒大多是国外进口的试剂盒，其虽然提取效果较好，但是价格昂贵，为消费者带来了沉重的经济负担。本领域急需能够经济、高效、稳定实现游离DNA提取的更优方案。
技术实现思路
本专利技术提供了用于提取游离DNA的试剂盒和方法，更特别地提供了用于提取血浆或血清中游离DNA的试剂盒和方法。本专利技术的试剂盒和方法通过其特定的试剂组合，以高提取效率、低提取下限和优良的稳定性实现了对样品中、特别是血浆或血清中游离DNA的可靠提取。本专利技术的试剂盒主要包含以下组分：核酸提取试剂(2)，其包含异硫氰酸胍35-45g/100ml，曲拉通(TX-100)5％-20％(v/v)，柠檬酸0-2g/L，柠檬酸钠0-15g/L，MgCl20-2g/L，异丙醇10％-40％，pH4.0-7.0；核酸提取试剂(4)，其包含异硫氰酸胍10-40g/100mL，TRIS碱5-15g/L，曲拉通(TX-100)5-20％(v/v)，EDTA0-10g/L，pH6.0-8.0，任选地还含有无水乙醇50-80％(v/v)；核酸提取试剂(5)，其包含TRIS碱0-15g/L，pH8.0-10.0，任选地还含有无水乙醇50-80％(v/v)；和核酸提取试剂(6)，其包含Tris碱0-2g/L，pH7.0-9.0。本专利技术的核酸提取试剂(2)中柠檬酸的含量为0-2g/L,优选1-2g/L，更优选1.5-2g/L。核酸提取试剂(2)中柠檬酸钠含量为0-15g/L，优选0-10g/L，更优选5-10g/L。核酸提取试剂(2)的pH为4.0-7.0，优选4.0-6.0，更优选4.0-5.0。在本专利技术的试剂盒的一个优选的实施方式中，核酸提取试剂(2)包含异硫氰酸胍40-45g/100ml，曲拉通15-20％(v/v)，柠檬酸1-2g/L，柠檬酸钠0-10g/L，MgCl21-2g/L，异丙醇30％-40％，pH4.0-6.0。本专利技术的核酸提取试剂(4)中，TRIS碱含量为5-15g/L，优选10-15g/L，更优选12-15g/L。核酸提取试剂(4)的pH为6.0-8.0，优选7.0-8.0，更优选7.0-7.5。在本专利技术的试剂盒的一个优选的实施方式中，核酸提取试剂(4)优选地包含异硫氰酸胍20-40g/100mL，TRIS碱10-15g/L，曲拉通(TX-100)10-15％(v/v)，EDTA5-10g/L，pH7.0-8.0，任选地还含有无水乙醇50-60％(v/v)。本专利技术的核酸提取试剂(5)中，TRIS碱含量为0-15g/L，优选10-15g/L，更优选10-13g/L。核酸提取试剂(5)的pH为8.0-10.0，优选9.0-10.0，更优选9.0-9.5。在本专利技术的试剂盒的一个优选的实施方式中，核酸提取试剂(5)优选地包含TRIS碱10-15g/L，pH9.0-10.0，任选地还含有无水乙醇60-80％(v/v)。在本专利技术的试剂盒的一个优选的实施方式中，无水乙醇在使用前添加至核酸提取试剂(4)和核酸提取试剂(5)中。本专利技术的试剂盒还可以包含核酸提取试剂(1)，通常为细胞裂解试剂。例如在一个实施方式中，本专利技术的试剂盒还包含作为核酸提取试剂(1)的蛋白酶K。在一个优选的实施方式中，核酸提取试剂(1)为10-40mg/mL的蛋白酶K。在一个更优选的实施方式中，核酸提取试剂(1)是20mg/mL的蛋白酶K。本领域技术人员可以理解，在其他实施方式中，本专利技术的试剂盒还可1以使用其他种类的细胞裂解试剂，例如溶菌酶，或者甚至不使用细胞裂解试剂，而是采用其他机械或物理方式来来裂解细胞。本专利技术的试剂盒还可以包含核酸提取试剂(3)，通常是核酸分子结合试剂。本领域技术人员熟知的核酸分子结合试剂包括本领域公知适用于磁珠法提取核酸的任何磁珠，包括可商购的各种磁珠，如硅基包被磁珠、氨基包被磁珠、羧基包被磁珠等。例如在一个实施方式中，本专利技术的试剂盒为磁珠法核酸提取试剂盒，其包含作为核酸提取试剂(3)的磁珠。在一个优选的实施方式中，核酸提取试剂(3)为10-50mg/mL的磁珠。在一个更优选的实施方式中，核酸提取试剂(3)为25mg/mL的磁珠。本专利技术还涉及使用本专利技术的核酸提取试剂盒提取样品中游离DNA的方法，特别是提取血浆或血清中游离DNA的方法。在一个优选的实施方式中，使用所述试剂盒提取游离DNA的流程如下：a)向1.5ml低吸附离心管中加入20μl核酸提取试剂(1)，10μl核酸提取试剂(3)，400μl血浆样本，涡旋混匀。b)向离心管中加入550μl核酸提取试剂(2)，室温颠倒混匀15min。c)瞬离离心管，将离心管置于磁力架上2min。d)去上清，向离心管中加入500μl加了无水乙醇的核酸提取试剂(4)，涡旋混匀15s。e)瞬离离心管，将离心管置于磁力架上2min。f)去上清，向离心管中加入500μl加了无水乙醇的核酸提取试剂(5)，涡旋混匀15s。g)瞬离离心管，将离心管置于磁力架上2min。h)去上清，瞬离离心管，将离心管置于磁力架上1min，用10μl枪头吸尽残液，室温干燥两分钟。i)向离心管中加入30-50μl核酸提取试剂(6)，涡旋混匀10s，60℃温育10min。j)将温育完成的离心管置于磁力架2min。k)转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于提取样品中游离DNA的试剂盒，包含以下组分：核酸提取试剂(2)，其包含异硫氰酸胍35‑45g/100ml，曲拉通(TX‑100)5％‑20％(v/v)，柠檬酸0‑2g/L，柠檬酸钠0‑15g/L，MgCl2 0‑2g/L，异丙醇10％‑40％，pH 4.0‑7.0；核酸提取试剂(4)，其包含异硫氰酸胍10‑40g/100mL，TRIS碱5‑15g/L，曲拉通(TX‑100)5‑20％(v/v)，EDTA 0‑10g/L，pH 6.0‑8.0，任选地还含有无水乙醇50‑80％(v/v)；核酸提取试剂(5)，其包含TRIS碱0‑15g/L，pH8.0‑10.0，任选地还含有无水乙醇50‑80％(v/v)；和核酸提取试剂(6)，其包含Tris碱0‑2g/L，pH7.0‑9.0。

【技术特征摘要】
1.用于提取样品中游离DNA的试剂盒，包含以下组分：核酸提取试剂(2)，其包含异硫氰酸胍35-45g/100ml，曲拉通(TX-100)5％-20％(v/v)，柠檬酸0-2g/L，柠檬酸钠0-15g/L，MgCl20-2g/L，异丙醇10％-40％，pH4.0-7.0；核酸提取试剂(4)，其包含异硫氰酸胍10-40g/100mL，TRIS碱5-15g/L，曲拉通(TX-100)5-20％(v/v)，EDTA0-10g/L，pH6.0-8.0，任选地还含有无水乙醇50-80％(v/v)；核酸提取试剂(5)，其包含TRIS碱0-15g/L，pH8.0-10.0，任选地还含有无水乙醇50-80％(v/v)；和核酸提取试剂(6)，其包含Tris碱0-2g/L，pH7.0-9.0。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述核酸提取试剂(2)优选地包含异硫氰酸胍40-45g/100ml，曲拉通15-20％(v/v)，柠檬酸1-2g/L，柠檬酸钠0-10g/L，MgCl21-2g/L，异丙醇30％-40％，pH4.0-6.0。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述核酸提取试剂(4)优选地包含异硫氰酸胍2...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖世玉，刘春晖，杨丽，郑志建，念波，
申请(专利权)人：迈凯基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51