一种氮高效融合基因SA及其应用制造技术

一种氮高效融合基因SA及其应用。本发明专利技术利用“源”器官特异性启动子和细胞自噬关键基因通过人工拼接的方法构建了一个融合基因，命名为SA，其序列如SEQ ID NO.1所示。可利用SA融合基因构建植物双元表达载体并转化目标植物。本发明专利技术提供了在大豆中的实施例，证明将SA融合基因转入大豆后，可以特异性提高转基因大豆“源”器官中由细胞自噬介导的营养物质再动员效率，转基因大豆对低氮和低营养胁迫的耐受性显著增强；同时在低氮条件下种植的转基因大豆产量显著提高。另外，该融合基因也可以转入其它作物，以获得高效利用氮素的转基因新品种，这对于农业上减少化肥施用，降低生产成本，以及环境保护都具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种氮高效融合基因SA及其应用
：本专利技术属于植物基因工程领域，具体地说是将一种“源”器官特异性启动子和细胞自噬关键基因通过人工拼接的方法构建融合基因SA及其在转基因植物中的应用。该融合基因的转基因植株具有氮素利用效率提高并且产量提高的性状。
技术介绍
：随着世界人口的不断增加，人们对粮食的需求量也不断增长，但可耕种土地面积有限，因此，提高农作物产量是避免爆发粮食危机的重要途径。通常提高作物产量所采用的手段主要是增加化肥的施用，这不仅会增加生产成本，还会对环境造成污染。因此，选育出能够高效利用土壤中有限营养而高产的作物新品种对解决粮食危机具有重大意义。氮素是植物营养三要素之一。农作物生长过程中需要从土壤中吸收大量氮素，氮素的供应直接控制着农作物的品质和产量。植物对氮素的利用通过吸收、同化、转运和再动员等几个步骤来完成(Masclaux-Daubresse等，2010)。受根系吸收能力下降等因素的制约，施用氮肥并不能完全满足作物灌浆期的高氮需求。粮食产量的提高不仅仅依赖于氮肥的吸收，还依赖于种子成熟阶段氮素的再利用(Kichey等，2007)。提高氮素的再利用效率可以保证植物重新利用营养器官中的氮用于灌浆，有助于植物氮经济及减少开花后的外源氮需求。营养的回收再利用效率是作物产量的决定因素之一。作为植物最重要的营养器官，叶片既是主要的光合器官，也是衰老启动后营养物质再动员的主要“源器官”。叶片衰老过程中，主要胞器结构及胞内大分子降解，营养物质源源不断地外运以支持新生器官的生长和发育，而种子是再动员最主要的“库”，作物种子中高达95％的蛋白质合成依赖于衰老叶片中蛋白质降解形成的氨基酸向种子的转运(Taylor等，2010)。氮素由“源”向“库”的有效动员和运输对于作物产量性状形成和实现“低肥高产”具有重要意义(Sinclair等，2003；Sinclair等，2004；Ainsworth等，2012)。植物细胞自噬是叶片衰老过程中营养物质再动员和早期转运的主要形式，而且自噬是目前已知最高效的亚细胞降解途径(Mizushima等，2008)。在这一途径中，废弃的或者受损的蛋白和细胞器被隔离进自噬体中，然后被运送到液泡中降解，从而实现对细胞内有害物质的清除和营养元素的回收，在细胞水平及整株植物水平实现氮素的合理利用和有效分配。最新研究表明，自噬在氮素充分与氮素不足条件下都是植物体进行氮素再动员的主要形式。利用15N同位素标记指示的氮素再动员数据测定显示，自噬对氮素再动员中的贡献大约为50％(Guiboileau等，2012)。分离鉴定或创制在“源”器官中特异性高表达的细胞自噬关键基因，通过提高农作物“源”器官中氮素等营养物质的再动员效率以提高作物的氮素利用效率和产量的应用策略在高产、高效的作物分子育种中具有重要的应用前景，然而，目前尚无相关的研究报道。
技术实现思路
：本专利技术的目的是解决农作物在种植过程中氮素利用效率低，氮肥过度施用等问题，提供一种可提高农作物“源”器官中的氮素再动员效率、用于氮高效高产农作物培育的氮高效融合基因及其应用。本专利技术利用分子生物学技术获得了一个“源”器官特异性启动子驱动细胞自噬关键基因表达的融合基因，并提供其在转基因植物中的应用，为氮高效作物育种提供基因资源和操作策略。分别克隆了一个“源”器官特异性启动子和一个细胞自噬关键基因，通过人工拼接的方式构建得到一段长度为2105bp的融合基因，命名为SA，其核酸序列如序列SEQIDNO.1所示。本专利技术将SA融合基因转入大豆基因组中，可获得在衰老叶片等“源”器官中特异性过表达细胞自噬关键基因的转基因大豆株系，提高了“源”器官中大分子营养物质的再动员效率，促进了转基因植株在低氮和低营养胁迫下的营养生长，并最终提高了大豆产量，证明该融合基因具有提高转基因作物低氮和低营养耐受性、改善产量相关性状的潜力。本专利技术的技术方案：一种氮高效融合基因SA，其核酸序列选自：(a)如序列SEQIDNO.1所示的核酸序列；(b)与(a)限定的核酸序列至少有85％同源性的核酸序列。本专利技术提供了融合基因SA的获取方法。即通过人工拼接的方法将一种“源”器官特异性启动子与细胞自噬关键基因进行连接构建而成。对“源”器官特异性启动子设计PCR扩增引物如下(核苷酸序列如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3，其中SEQIDNO.3引入NcoI切点)：SEQIDNO.2：5’-AAGCTTCCTTGGTACCTTTCTCAGGGTAGTG-3’SEQIDNO.3：5’-CCATGGTCATGCTTGCTCTTGCTGTTTTGAT-3’对细胞自噬关键基因的CDS序列设计PCR扩增引物如下(SEQIDNO.4、SEQIDNO.5，其中SEQIDNO.4中引入NcoI酶切位点，SEQIDNO.5中引入BstPI酶切位点)：SEQIDNO.4：5’-ATTTCGCCATGGCCAAAACCTCCTTCAAGCTTC-3’SEQIDNO.5：5’-CGAGCTGGTCACCTAATGGGATCCGAAGGTGTTCT-3’。SA融合基因的构建步骤如下：第一、利用引物SEQIDNO.2和SEQIDNO.3，以大豆基因组DNA为模板，用PCR方法扩增SA融合基因的“源”器官特异性启动子部分，回收扩增产物并进行TA克隆；第二、利用引物SEQIDNO.4和SEQIDNO.5，以大豆cDNA为模板,用PCR方法扩增SA融合基因中的细胞自噬关键基因部分，回收扩增产物并进行TA克隆；第三、分别用HindIII/NcoI、NcoI/BstPI双酶切步骤(1)中含有融合基因中“源”器官特异性启动子的TA克隆质粒和步骤(2)中含有融合基因中细胞自噬关键基因的TA克隆质粒，分别回收上述核酸片段；第四、用HindIII/BstPI双酶切pCAMBIA3301质粒，回收大的载体片段；第五、混合步骤(3)中回收的“源”器官特异性启动子片段、细胞自噬关键基因片段和pCAMBIA3301载体片段，在连接酶催化下进行连接反应；第六、将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过抗性筛选获得在pCAMBIA3301载体上的SA融合基因的构建。本专利技术同时提供了SA融合基因的应用，用该融合基因构建植物双元表达载体，进行植物转化，从而获得基因组中含有以上SEQIDNO.1所述融合基因核酸序列的转基因植株；即将该基因在转基因植物中表达，用于提高转基因作物对“源”器官中氮素的再动员能力。所述应用中的一个实施例是SA融合基因在大豆中表达，这种转基因大豆“源”器官中自噬介导的营养物质再动员效率提高，对低氮和低营养胁迫的耐受性显著增强；在低氮土壤中种植比非转化对照生长更旺盛，茎围增大，分枝数增多，单株产量提高；具体操作过程如下：第七、将第六步所构建的含有SA融合基因的pCAMBIA3301载体转入农杆菌LBA4404；第八、采用农杆菌介导的子叶节大豆转化法将SA融合基因转入外植体(Paz等，2006)，经过6mg/L草铵膦筛选得到的抗性芽嫁接于野生型砧木后正常(16h光照/8h黑暗，25℃)培养；第九、采用基因组PCR和Southernblot的方法进行外源基因的插入和拷贝数鉴定，利用半定量RT-PCR的方法检测SA融合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氮高效融合基因SA，其核酸序列选自：(a)如序列SEQ ID NO.1所示的核酸序列；(b)与(a)限定的核酸序列至少有85％同源性的核酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种氮高效融合基因SA，其核酸序列选自：(a)如序列SEQIDNO.1所示的核酸序列；(b)与(a)限定的核酸序列至少有85％同源性的核酸序列。2.权利要求1所述融合基因SA的引物，其特征在于，设计用于SA融合基因的创制的引物4条，具体引物序列如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的核酸序列。3.构建权利要求1所述的融合基因SA的方法，其特征在于，所述融合基因是通过人工拼接的方法将一种“源”器官特异性启动子与细胞自噬关键基因进行连接构建的融合基因，具体操作步骤如下：(1)利用权利要求2所述引物SEQIDNO.2和SEQIDNO.3，以大豆基因组DNA为模板，用PCR方法扩增SA融合基因的“源”器官特异性启动子部分，回收扩增产物并进行TA克隆；(2)利用权利要求2所述引物SEQIDNO.4和SEQIDNO.5，以大豆cDNA为模板,用PCR方法扩增SA融合基因中的细胞自噬关键基因部分，回收扩增产物并进行TA克隆；(3)分别用HindIII/NcoI、NcoI/BstPI双酶切步骤(1)中含有融合基...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宁宁，刘生，王丹，夏铜梅，靳洁莉，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12