一种大豆伤诱导基因、其编码蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种大豆伤诱导基因、其编码蛋白及其应用。该基因为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明专利技术首次在大豆中克隆到一种全新的伤诱导基因GmWIP，通过在植物中组成型表达GmWIP基因证明了该基因及其编码的蛋白具有增强植物抗病性的功能。

【技术实现步骤摘要】
一种大豆伤诱导基因、其编码蛋白及其应用
本专利技术涉及一种大豆伤诱导基因、其编码蛋白及其应用。
技术介绍
植物细菌性病害是由细菌病原菌侵染所致的病害，如软腐病、溃疡病、青枯病等。细菌性病害是危害农业生产最严重的病害之一，疫情爆发时往往导致农作物大面积减产，甚至绝收。目前对细菌性病害的防控措施主要依赖于农药的使用，但是大量使用农药一方面容易使植物产生耐药性导致防治效果变差；另一方面农药，尤其是抗生素类农药的残留成为了威胁人畜健康的巨大隐患。近几十年来，大量研究表明植物体内存在着天然的免疫系统保护植物免受大部分病原菌的侵染。随着研究工作的深入，多个影响植物免疫反应的抗病因子被解析清楚，育种家应用这些关键抗病因子的编码基因育成了一批能够抗特定病原菌的农作物新品种，在保证农业稳产的同时减少了农药的使用，产生了显著的经济和生态效益。但是植物病原菌种类繁多，同时病原菌在选择压力下也会慢慢对现有的抗病基因产生耐受性，因此，挖掘新的抗病基因资源依然是当前植物抗病育种研究领域的重要方向。丁香假单胞菌（Pseudomonassyringae）属于假单胞菌科假单胞菌属，为好氧型革兰氏阴性菌，广泛分布于大气、土壤、水体及植物叶面等。丁香假单胞菌是一大类流行极广的植物病原细菌，可侵染豆科、十字花科、茄科等三百多种经济作物，其引发植物病害的发生率居细菌性植物病害之首，给农业生产造成巨大损失。丁香假单胞菌具有多个致病变种，其中番茄致病变种DC3000菌株（P.syringaepv.tomatoDC3000）作为模式菌种被广泛应用于植物抗病研究。本专利技术即采用该菌株测试不同遗传材料的抗病性。以大豆为代表的豆科植物能够形成根瘤与定殖于其中的根瘤菌共生固氮。研究表明，多个根瘤高表达的基因与植物的免疫反应密切相关。伤诱导蛋白（Wound-InducedProtein，WIP）是一类由受伤诱导表达的基因编码的小分子量蛋白，通常含有81-97个氨基酸残基，均含有一个保守的DUF3774结构域。由于鲜见报道，其生物学功能至今仍然很不清楚，因此是一类功能未知的全新的蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种大豆伤诱导基因。本专利技术的目的之二在于提供由该基因编码的大豆伤诱导蛋白。本专利技术的目的之三在于提供一种植物组成型表达载体，该载体含有本专利技术的基因。本专利技术的目的之四在于提供该基因在增强植物抗病方面的应用，其特征在于过表达GmWIP基因能够显著增加植物对病原细菌丁香假单胞菌的抗性。本专利技术在大豆根瘤中鉴定到一个高量表达的伤诱导基因，预测其具有增强植物抗病的功能。然而由于大豆的遗传转化十分困难，限制了相关研究的开展。在本专利技术中，我们采用模式植物拟南芥作为系统，研究大豆伤诱导基因及其编码蛋白在植物免疫反应中的功能。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种大豆伤诱导基因，其特征在于该基因具有SEQIDNO:1所示的碱基序列。一种上述的大豆伤诱导基因的编码蛋白，其特征在于该蛋白具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。一种载体，其特征在于该载体含有上述的大豆伤诱导基因。一种上述的大豆伤诱导基因在增强植物抗病性方面的应用。一种上述的大豆伤诱导基因的编码蛋白在增强植物抗病性方面的应用。本专利技术首次在大豆中鉴定并克隆到一个伤诱导基因GmWIP，通过构建植物组成型表达载体并遗传转化模式植物拟南芥，证明了该基因编码的伤诱导蛋白GmWIP具有增加植物抗细菌性病害的功能，为作物抗病分子育种提供了重要的基因资源。附图说明图1为本专利技术的GmWIP基因的植物组成型表达载体35S:GmWIP的构建示意图。图中仅展示该载体的核心部件，即目的基因相关的35S:GmWIP构建和卡那霉素抗性相关的35S:KanR构建。图2为本专利技术的35S:GmWIP转基因拟南芥株系中目的基因GmWIP的表达量。利用qRT-PCR技术检测了野生型对照（Col-0）及代表性转基因株系叶片中GmWIP的转录水平，由图可见，第3和12号转基因株系中GmWIP的表达量较高，成功实现了过表达。图3为本专利技术的35S:GmWIP转基因拟南芥的抗病表型。（A）四周龄的野生型对照（Col-0）与转基因株系（#3，#12）叶片接种丁香假单胞菌三天后的表型，标尺均为1cm。由叶片病斑大小可见转基因株系的抗病性显著高于对照。（B）为（A）中叶片活菌数定量统计，不同字母代表显著性差异，p<0.01,ANOVA。可见，转基因植株叶片中病原菌数量显著少于对照，证明GmWIP增加了植物抗病性。具体实施方法下面结合具体实施事例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆（MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.）或植物分子生物学－实验手册（PlantMolecularBiology－ALaboratoryManual,MelodyS.Clark编，Springer-verlagBerlinHeidelberg,1997）中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一：克隆GmWIP基因通过生物信息学方法研究发现大豆（Glycinemax）根瘤转录组中高量表达一个预测为伤诱导蛋白的编码基因GmWIP。以大豆根瘤cDNA为模板，运用聚合酶链式反应（PCR）方法克隆了GmWIP基因的CDS序列。该CDS序列全长255bp，编码由84个氨基酸残基组成的蛋白。这一结果与大豆基因组数据库（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/）公布的有关GmWIP基因的相关序列信息完全一致。实施例二：构建GmWIP组成型表达载体首先用分别带有限制性酶切位点XhoI和BamHI的上游和下游引物PCR克隆GmWIPCDS序列，通过酶切—连接系列反应将GmWIPCDS连入中间载体pA7上，得到35S:GmWIP-pA7中间载体。然后用HindIII和EcoRI双酶切反应将35S:GmWIP片段切下并连入双元载体pCAMBIA2301上，得到最终的35S:GmWIP-pCAMBIA2301载体。实施例三：GmWIP组成型表达载体转化拟南芥将上述构建完成的35S:GmWIP-pCAMBIA2301载体通过热激法转化进入农杆菌菌株GV3101中，再通过蘸花法经由农杆菌侵染介导将目的基因转化进入拟南芥中。通过卡那霉素平板筛选获得转基因阳性植株，再经过两代自交繁殖后获得T3代纯合转基因植株。实施例四：组成型表达GmWIP的转基因拟南芥的抗病表型分析（1）转基因植物叶片中GmWIP表达量检测：首先抽提转基因阳性株系叶片的总RNA，具体操作方法如下（Omega植物RNA抽提试剂盒）：1）称取约0.1g幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速研磨成细粉，装于1.5mL的离心管中。2）加入500μLRCL，用力摇动使混合均匀，55℃放置2-3min。离心（室温，10000rpm，5min）。3）将上清液（约450μL）转移至去除基因组的柱子中。离心（室温，14000rpm，2min）。4）弃柱子，向溶液中加等体积RCB，吹打混匀，转移至RNA吸附柱中。离心（室温，12000rpm，1min）。5）弃溶液，加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大豆伤诱导基因，其特征在于该基因具有SEQ ID NO: 1所示的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.一种大豆伤诱导基因，其特征在于该基因具有SEQIDNO:1所示的碱基序列。2.一种根据权利要求1所述的大豆伤诱导基因的编码蛋白，其特征在于该蛋白具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。3.一种载体，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：于亮亮，罗利，闫军辉，王亚雯，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海,31