高效的木糖代谢产乙醇的工业菌株及方法技术

本发明专利技术涉及乙醇的生物制备领域，具体地涉及高效的木糖代谢产乙醇的工业菌株及方法。所述工业菌株的保藏编号为CGMCC No.15568。通过组成型的强启动子将包括木糖还原酶XR基因，木糖醇脱氢酶XDH基因，木酮糖激酶XK基因，以及2份拷贝的木糖转运蛋白基因mgt05196，TAL1，和2份拷贝PYK1基因的基因表达簇整合到酿酒酵母中，从而改善其葡萄糖代谢能力，木糖代谢能力，以及乙醇的产量。

【技术实现步骤摘要】
高效的木糖代谢产乙醇的工业菌株及方法
本专利技术涉及乙醇的生物制备领域，具体地涉及高效的木糖代谢产乙醇的工业菌株及方法。
技术介绍
燃料乙醇是一种新型的可再生清洁能源，可以在各种生物质的作用下通过相应的微生物发酵得到。木质纤维素是自然界存在的含量最丰富的有机的可再生资源之一，取之不尽用之不竭，是目前国际最主流的工业乙醇的发酵原料。木质纤维素通过水解作用生成多种单糖，其中含量最为丰富的是葡萄糖和木糖，木糖的含量仅次于葡萄糖。同时，水解过程会产生一些对酿酒酵母有毒或有抑制作用的物质，如乙酸、呋喃和糠醛，其中乙酸的含量较高，对酿酒酵母产生主要的抑制和毒害作用。酿酒酵母代谢葡萄糖产乙醇是通过糖酵解途径。在一系列酶的催化作用下，一分子葡萄糖转化为磷酸烯醇式丙酮酸，而在丙酮酸激酶PYK1作用下最终生成两分子丙酮酸，继而丙酮酸在丙酮酸脱羧酶PDC的催化作用下生成乙醛，最终乙醛在乙醇脱氢酶ADH的作用下生成了乙醇。因此，需要增强酿酒酵母菌的乙酸耐受和乙酸代谢率，这对于提高木质纤维素水解液中乙醇发酵水平，促进乙醇的工业化生产有很大的帮助
技术实现思路
本专利技术为了解决如何提高酿酒酵母的木糖代谢能力，乙酸耐受能力，乙醇产率等等问题，研究不同菌株增加不同拷贝数的“基因表达簇”，以及组合乙酸耐受基因等多种基因的表达对于具备良好的木糖代谢能力和乙酸耐受能力的重组酿酒酵母菌的乙醇发酵性能的影响。根据本专利技术的木糖代谢产乙醇的工业菌株其保藏编号为CGMCCNo.15568。根据本专利技术的提高酿酒酵母的木糖代谢能力和乙醇产率的方法，所述方法包括步骤：选取基因表达簇：木糖还原酶XR基因，木糖醇脱氢酶XDH基因，木酮糖激酶XK基因，以及2份拷贝的木糖转运蛋白基因mgt05196，TAL1，和2份拷贝PYK1基因，选择组成型的强启动子pPGK1、pADH1、pTDH3、pTEF1来随机表达以上六种基因PYK1、TAL1、XR、XDH、XK和mgt05196，并整合到酿酒酵母基因组中。根据本专利技术的提高酿酒酵母的木糖代谢能力和乙醇产率的方法，所述方法进一步包括增加上述基因表达簇拷贝数的步骤。根据本专利技术的具体实施方式，在单倍体酿酒酵母菌E7(保藏编号为CGMCCNo.15567)的基础上，不断增加“基因表达簇”的拷贝次数，一次拷贝，二次拷贝，菌株的发酵性能逐步提升，糖醇转化率方面初始菌E7，一次拷贝菌1Z(保藏编号为CGMCCNo.15568)，二次拷贝菌1Z1Z三者的糖醇转化率分别为45.08％、47.74％、48.19％，分别达到了理论转化率的88.40％、93.6％、94.5％，但是再进行第三次拷贝数增加构建1Z1Z1Z后，菌株的糖醇转化率是47.97％，到了理论转化率的94.1％，对菌株的发酵性能没有提升作用。根据本专利技术的提高酿酒酵母的木糖代谢能力和乙醇产率的方法，所述方法进一步包括在二次拷贝菌1Z1Z的基础上，通过酿酒酵母内源的多拷贝位点delta的rDNA的基因重组，随机多拷贝表达上述基因簇的步骤。根据本专利技术的具体实施方式，进一步单倍体菌株1Z1Z的基础上进行了“基因表达簇”的随机多拷贝表达，验证其作用是否已经接近阈值。1Z1Z的基础上，通过酿酒酵母内源的多拷贝位点delta的rDNA的基因重组，得到4株性能较好的“基因表达簇”的随机多拷贝表达菌。发酵性能方面，四株菌的乙醇产量都很高，糖醇转化率分别是49.92％，46.14％，49.44％，49.44％；木糖代谢能力DELTA9最强，发酵48h代谢了40.46g木糖，其余三种菌的木糖代谢分别是35.8g、36.3g、35.9g，副产物甘油和木糖醇都较高，乙酸代谢能力较低。探究四株菌的六个基因的转录，发现：(1)XR(K270R)、XDH、PYK1的高表达可以促进细胞的木糖代谢，增加木糖消耗量，此外，如果这三者没有实现同步的基因拷贝数和表达量，出现表达量的差异，会直接导致中间产物木糖醇的积累和副产物甘油的增多；(2)高表达PYK1可以很好的促进糖分子转化为乙醇，糖醇转化率较高。(3)在已经可以进行木糖代谢的菌种中，高表达TAL1，可以促进木糖的代谢，但同时要提高木糖代谢基因表达，否则容易造成副产物的累积。据本专利技术的提高酿酒酵母的木糖代谢能力和乙醇产率的方法，所述酿酒酵母为二倍体酿酒酵母，所述方法进一步包括再增加一份拷贝的所述基因表达簇并且与乙酸耐受基因HAA1和PMA1共同表达的步骤。根据本专利技术的具体实施方式，在二倍体酿酒酵母A21Z的基础上，研究增加“基因表达簇”的拷贝次数对二倍体酵母的发酵性能影响。增加一份拷贝数的菌株经实验发现，与初始菌相比在乙醇产量和产率上没有太明显的变化，二者的副产物木糖醇差别也较小，乙酸消耗比初始菌株少，但增加一份拷贝数的菌增加了1.33g的木糖消耗。为此，在菌体A21Z中导入乙酸耐受相关的基因HAA1和PMA1，与“基因表达簇”共同转酵母以探究其发酵性能的变化，得到菌株HAA1-PMA1，实验发现，糖醇转化率较A21Z以及单独的基因表达簇二次拷贝的菌都有提高，因此，增加“基因表达簇”的拷贝次数可以增加酵母菌的乙醇发酵性能，但并不能提高乙酸的代谢利用能力。本专利技术提供了高效的木糖代谢产乙醇的工业菌株及方法，该菌株具有改善的在葡萄糖代谢能力，显著提高的木糖代谢能力，以及提高的乙醇的产量，E7、1Z、1Z1Z随着表达簇拷贝数的增加产量逐渐增加，具体表现为E7、1Z、1Z1Z乙醇最高产量分别为53.2g/L、55.1g/L、55.3g/L，糖醇转化率分别是45.08％、47.74％、48.19％，分别达到了理论转化率的88.40％、93.6％、94.5％。附图说明图1为载体T1-Z1、T2-Z2、T3-Z3、T4-Z4的图谱。图2显示3g/L乙酸、80g/L葡萄糖、40g/L木糖的混合糖培养基中E7(A)、1Z(B)、1Z1Z(C)、(D)1Z1Z1Z的发酵结果。图3显示80g/L葡萄糖、40g/L木糖和3g/L乙酸条件下1Z1Z以及8株菌在发酵36h、48h时的糖醇转化率(A)，木糖消耗(B)以及乙醇产率(C)。图4显示3g/L乙酸、80g/L葡萄糖、40g/L木糖的混合糖发酵中1Z1Z(A)DELTA7(B)、DELTA9(C)、rDNA8(D)、rDNA12(E)发酵结果。图5显示酵母菌株DELTA7(d7)、DELTA9(d9)、rDNA8(r8)、rDNA12(r12)的六种基因XR(K270R)、XDH、XK、TAL1、PYK1和mgt05196的转录水平。图6显示酵母菌株DELTA7(d7)、DELTA9(d9)、rDNA8(r8)、rDNA12(r12)的六种基因XR(K270R)、XDH、XK、TAL1、PYK1和mgt05196的转录水平图7为载体T5-HAA1-PMA1图谱；图8显示3g/L乙酸、80g/L葡萄糖40g/L木糖的混合糖发酵中，A21Z(A)，HAA1-PMA1(B)的发酵结果。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)E7保藏编号为CGMCCNo.15567，于2018年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，1001本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.木糖代谢产乙醇的工业菌株，其特征在于，所述工业菌株的保藏编号为CGMCC No.15568。

【技术特征摘要】
1.木糖代谢产乙醇的工业菌株，其特征在于，所述工业菌株的保藏编号为CGMCCNo.15568。2.一种提高酿酒酵母的木糖代谢能力和乙醇产率的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：通过组成型的强启动子将基因表达簇整合到酿酒酵母基因组中，其中，所述基因表达簇包括：木糖还原酶XR基因，木糖醇脱氢酶XDH基因，木酮糖激酶XK基因，以及2份拷贝的木糖转运蛋白基因mgt05196，TAL1，和2份拷贝PYK1基因。3.根据权利要求2所述的提高酿酒酵母的木糖代谢能力和乙醇产率的方法，其特征在于，所述酿酒酵母为保藏编号为CGMCCNo.15567的单倍体酿酒酵母。4.根据权利要求2所述的提高酿酒酵母的木糖代谢能力和乙醇产率的方法，其特征在于，所述组成型的强启动子为启动子pPGK1...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹利民，萧伟，刘文博，张梅，
申请(专利权)人：首都师范大学，
类型：发明
国别省市：北京,11