一种高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株及其构建方法、发酵工艺与应用技术

本发明专利技术公开了一株高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株及其构建方法、发酵工艺与应用，该工程菌株为表达来自曲霉菌株HAT418的cadA和mttA基因的解脂耶氏酵母。本发明专利技术通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和非同源重组技术实现了衣康酸高产土曲霉的顺乌头酸脱羧酶基因(cadA)和线粒体顺乌头酸转运蛋白基因(mttA)在解脂耶氏酵母中的高表达，筛选到的解脂耶氏酵母工程菌株发酵衣康酸产量高、纯度高。

【技术实现步骤摘要】
一种高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株及其构建方法、发酵工艺与应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株及其构建方法、发酵工艺与应用。
技术介绍
衣康酸又称甲叉丁二酸、亚甲基琥珀酸，由于分子结构中含有两个羧基团、一个亚甲基、一个双键，决定了其具有十分活泼的化学性质，可以自身聚合，也可以和其他分子发生加成、聚合等化学反应，是一种应用前景十分广阔的化学合成中间体，广泛应用于化工、医药、造纸、印刷等领域(Willkeetal.,2001；Okabeetal.,2009)，2004年被美国能源局评为12种生物基平台化合物之一(Werpyetal.,2004)。由于环保压力导致生物基材料需求的不断增加，到2020年衣康酸市场有望突破2.16亿美元(JulianaCunhadaCruzetal,2018)。当前，衣康酸主要采用土曲霉菌株发酵法生产(Kuenzetal.,2012；AntjeHevekerletal.,2014)。研究推测土曲霉中的衣康酸合成途径为：衣康酸合成的前体为TCA循化中间产物顺乌头酸，顺乌头酸是由顺乌头酸酶ACO(acoA)催化柠檬酸合成的。在线粒体中的合成的顺乌头酸由线粒体转运蛋白MTT(mttA)转运至细胞胞质中，之后在顺乌头酸脱羧酶CAD(cadA)作用下脱羧生成衣康酸，然后可能由定位于细胞膜上的非特异性转运蛋白MFS(mfsA)转运出胞外(图1)(AnLietal.,2011；Okabeetal.,2009；KlementandBüchs,2013,ShinKanamasaetal.,2008)。相比酵母，土曲霉生长相对缓慢，且对剪切力的耐受性较差，同时缺乏基因工程工具，限制了土曲霉通过基因工程手段进一步改造成优良工程菌(PeichingChangetal.,2017)。为此，研究人员开始尝试采用黑曲霉、大肠杆菌(-Johannesharderetal.,2016)、谷氨酸棒杆菌(OttenA.etal.,2015)、酿酒酵母(JohnBlazecketal.,2014)等宿主通过基因工程手段成功构建可以积累衣康酸的工程菌株。与以上这些菌种相比，解脂耶氏酵母生长迅速，耐剪切的能力强，且当前耶氏酵母的基因操作工具也逐渐增多，使其成为更具优势的具有工业化潜力的代谢工程平台菌株(F.A.G.etal.,2014；Rywin’Ska,A.etal.,2013,Schwartzetal.,2016)，目前，耶氏酵母已经作为宿主菌用于琥珀酸、β-胡萝卜素等工程菌株的构建，并取得很好结果。2015年Blazeck等人首次尝试在耶氏酵母中胞质中过表达cadA和acoA基因，筛选到可以积累衣康酸的工程菌株，优化后工程菌株衣康酸产量达到4.6g/L，相比工业生产中土曲霉80g/L衣康酸产量还有较大差距。
技术实现思路
针对现有技术，本专利技术提供一株高产衣康酸的解脂耶氏酵母基因工程菌株及其构建方法。同时，提供该工程菌株用于衣康酸发酵工艺。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的第一个方面，提供一株高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株，其特点是：该工程菌株是表达了来自衣康酸高产土曲霉菌株HAT418的cadA和mttA基因的解脂耶氏酵母。本专利技术的第二个方面，提供所述高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，该方法包括：将cadA和mttA与表达载体连接，制备得到含有目的基因的表达载体，再将表达载体转化进入解脂耶氏酵母细胞内，筛选获得携带cadA和mttA基因并能够进行表达的解脂耶氏酵母工程菌株。本专利技术的第三个方面，提供所述高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株在制备衣康酸中的应用。本专利技术的第四个方面，提供所述高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株发酵生产衣康酸方法。与现有技术相比，本专利技术的技术方案具有如下技术效果：(1)本专利技术通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和非同源重组技术实现了衣康酸高产土曲霉的顺乌头酸脱羧酶基因(cadA)和线粒体顺乌头酸转运蛋白基因(mttA)在解脂耶氏酵母中的高效表达，筛选到的解脂耶氏酵工程菌株的衣康酸产量高。(2)本专利技术构建的解脂耶氏酵母工程菌株所产衣康酸纯度高，副产物产量低。(3)本专利技术构建的解脂耶氏酵母衣康酸生产工程菌株进行衣康酸发酵无需对发酵液pH进行调节，不仅减少原材料的消耗，同时也简化衣康酸后提取工艺。(4)本专利技术构建的解脂耶氏酵母衣康酸生产工程菌株，通过补料发酵衣康酸的产量可达21.35g/L。属于同类技术的先进水平。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1：土曲霉衣康酸生物合成途径。图2：在PC-7菌株中过表达acoA、mfsA和mttA基因，筛选的转化子衣康酸发酵结果。图3：在PC-MTT菌株中过表达acoA和mfsA基因，筛选的转化子衣康酸发酵结果。图4：氮源对本专利技术构建的高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株PCM-URA衣康酸发酵的影响。图5：本专利技术构建的高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株PCM-URA分批补料发酵生产衣康酸。A：转速400rpm，发酵过程pH不控制；B:转速300rpm，发酵过程通过4MNaOH控制pH3.2；C：转速300rpm，发酵过程pH不控制。(□衣康酸；△葡萄糖；○OD600；◇pH；---溶解氧(DO))。图6：高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株分批补料发酵液HPLC谱图。峰6-17.793为衣康酸。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。正如
技术介绍
所介绍的，现有技术中合成衣康酸的基因工程菌株均存在一定的不足，为了解决如上的技术问题，本专利技术提拱了一株高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株，其特点是：该工程菌株为表达来自衣康酸高产土曲霉菌株HAT418的cadA和mttA基因的解脂耶氏酵母。在本专利技术一个优选的实施方式中，所述cadA基因的核酸序列如SEQIDNo.1所示，所述mttA基因的核酸序列如SEQIDNo.2所示。在本专利技术一个优选的实施方式中，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将cadA基因整合到解脂耶氏酵母基因组中进行表达。在本专利技术一个优选的实施方式中，采用非同源重组的方式将mttA基因整合到解脂耶氏酵母基因组进行表达。在本专利技术一个优选的实施方式中，解脂耶氏酵母工程菌株积累衣康酸，该工程菌株通过分批补料发酵的衣康酸发酵产量达到21g/L及以上。在本专利技术一个优选的实施方式中，所述cadA和mttA基因来自衣康酸高产土曲霉菌株HAT418，来自刘建军等人的《发酵法生产衣康酸技术的研究(Ⅰ)》，为山东省食品发酵工业研究设计院选育、保藏菌株。解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株，其特征是：该工程菌株为表达来自曲霉菌株HAT418的顺乌头酸脱羧酶基因(cadA)和顺乌头酸转运蛋白基因(mttA)的解脂耶氏酵母。

【技术特征摘要】
1.一株高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株，其特征是：该工程菌株为表达来自曲霉菌株HAT418的顺乌头酸脱羧酶基因(cadA)和顺乌头酸转运蛋白基因(mttA)的解脂耶氏酵母。2.如权利要求1所述的工程菌株，其特征是：cadA基因的核酸序列如SEQIDNo.1所示，mttA基因的核酸序列如SEQIDNo.2所示。3.如权利要求1所述的工程菌株，其特征是：采用整合到基因组或采用表达质粒载体的方式进行表达；优选的，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将cadA基因整合到解脂耶氏酵母基因组中进行表达；采用非同源重组的方式将mttA基因整合到解脂耶氏酵母基因组进行表达。4.如权利要求1所述的工程菌株，其特征是：所述解脂耶氏酵母亲株为解脂耶氏酵母株Po1f菌株。5.权利要求1～4中任一项中所述的高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，其特征是，包括以下步骤：将cadA和mttA基因与表达载体连接，制备得到含有目的基因的表达载体，再将该表达载体转化进入解脂耶氏酵母，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将cadA整合到基因组制定位点，通过非同源重组将mttA整合到基因组非特定位点，即获得高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株。6.如权利要求5所述的构建方法，其特征是，该构建方法具体包括以下步骤：(1)cadA和mttA目的基因的制备与扩增；(2)目的基因与表达载体的链接，制备得到含有目的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建军，赵晨，赵祥颖，张家祥，张立鹤，田延军，贺强之，
申请(专利权)人：山东省食品发酵工业研究设计院，
类型：发明
国别省市：山东,37