一种生产酪醇及羟基酪醇的酵母及构建方法技术

本发明专利技术涉及一种生产酪醇及羟基酪醇的酵母及构建方法，属于有机化合物制备技术领域，将PcAAS和ADH序列导入酵母BY4741，得到生产酪醇的PcAAS‑ADH重组酵母；在所述PcAAS‑ADH重组酵母中导入pdc1基因敲除盒、tyrA表达盒得到生产酪醇的PcAAS‑ADH‑Δpdc1‑tyrA重组酵母；将HpaBC的DNA序列导入PcAAS‑ADH‑Δpdc1‑tyrA重组酵母，得到生产羟基酪醇的PcAAS‑ADH‑HpaBC‑Δpdc1‑tyrA重组酵母。在酵母BY4741中构建酪醇或羟基酪醇生物合成途径，提高酪醇或羟基酪醇的产量。

A yeast producing tyramol and hydroxytyramol and its construction method

The present invention relates to a yeast for producing tyrosol and hydroxy tyrosol and its construction method, belonging to the field of organic compound preparation technology. PcAAS and ADH sequences are introduced into yeast BY4741 to obtain tyrosol-producing PcAAS ADH recombinant yeast. The PDC1 gene knockout box and tyrA expression box are introduced into the PcAAS ADH recombinant yeast to produce tyrosol. Recombinant yeast PCAAS_ADH_pdc1_tyrA was obtained by introducing the DNA sequence of HpaBC into PcAAS_ADH_pdc1_tyrA recombinant yeast to produce hydroxy tyrol. The biosynthesis pathway of tyrosol or hydroxy tyrosol was constructed in yeast BY4741 to increase the yield of tyrosol or hydroxy tyrosol.

【技术实现步骤摘要】
一种生产酪醇及羟基酪醇的酵母及构建方法
本专利技术属于生物工程
，涉及一种高产酪醇的基因重组酵母及一种异源合成羟基酪醇的酿酒酵母，以及所述酵母的构建方法。
技术介绍
酪醇是天然的抗氧化剂，来源于橄榄油，是苯乙醇的一种衍生物。别名红景天苷元，是红景天的主要药用活性成分，是红景天苷、羟基酪醇的前体物质。可以保护细胞免受氧化伤害，是一种具有重要工业价值的酚类化合物，酪醇及其衍生物是多种有机化合物的合成前体，酪醇可被用于医药剂。酪醇的衍生物羟基酪醇是一种具有很强的抗氧化作用及多种生理医药功能，羟基酪醇的抗氧化性强于酪醇，同时可以合成很多聚合物，且没有已知毒性，在生物医药、功能食品等行业应用广泛，具有预防心血管、骨质缺乏等疾病的发生。目前，羟基酪醇的获得主要是从橄榄叶中提取，从植物中提取，成本高，占用大量的耕地。化学法中利用苯乙醇合成法，大多先采用保护羟基，然后硝化、还原、重氮化、水解得到对羟基苯乙醇，收率为70％。苯乙醇价格高供应紧张，利用硝基甲苯合成，价格低廉但步骤较长，产率低，利用对羟基苯乙烯合成产率达到96％，纯度99％，产率和纯度都很高，具有一定的价值，但原料成本较高。化学法制备酪醇原料成本高且环境不友好，这些都直接制约了酪醇的工业化生产。因此，生物法合成酪醇和羟基酪醇已经成为研究热点。酪醇(Tyrosol)具有以下特征：化学名称为4-(2-Hydroxyethyl)phenol，分子式为C8H10O2，分子量为138.164，CAS号为501-94-0，结构式为多项专利成功构建了产酪醇的基因重组大肠杆菌。专利名：“一种在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法及应用”(申请号201310133238.7)；专利名：“一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株及其应用”(申请号201410115011.4)；专利名：“利用葡萄糖生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及重组方法及应用”(申请号201510242626.8)；专利名：“一种产酪醇的重组菌株及其构建方法”(申请号201710091999.9)；专利名：“异源代谢途径生产酪醇及羟基酪醇的方法”(申请号201711054680.5)。但是大肠杆菌内毒素的去除是大规模工业生产中的一个重大挑战。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，也称为脂多糖。脂多糖对人体能够产生毒性。“Methodsfortheimprovementofproductyieldandproductioninamicroorganismthtoughtheadditionofalternateelectronacceptors”中公开了一种重组酵母，利用酶转化调节代谢途径，生产甘油的方法。“Breedingofahightyrosol-producingsakeyeastbyisolationofanethanol-resistantmutantfromatrp3mutant”公开了从酿酒酵母的色氨酸营养突变体中分离出一种耐乙醇的突变体，研制出了一种新型的高酪蛋白酵母菌育种策略。同时，尚未检索到利用酵母，特别是酿酒酵母，生产酪醇和羟基酪醇的生物合成技术。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的之一是提供一种生产酪醇的酵母。开发一种重组酵母，在酵母BY4741中构建酪醇生物合成途径，敲除酵母BY4741基因模板中的pdc1的基因片段，减弱酵母菌中合成乙醇的途径，提高酪醇的产量，并通过导入能够将生产酪醇的基因进一步转化成羟基酪醇的羟化酶基因，构建异源合成羟基酪醇的酵母菌株。本专利技术的目的之二是提供一种生产羟基酪醇的酵母。本专利技术的目的之三是提供一种生产酪醇的酵母的构建方法。本专利技术的目的之四是提供一种生产羟基酪醇的酵母的构建方法。本专利技术的目的之五是提供所述一种生产酪醇的酵母或构建方法在生产酪醇中的应用。本专利技术的目的之六是提供所述一种生产羟基酪醇的酵母或构建方法在生产羟基酪醇中的应用。为了解决以上技术问题，本专利技术的技术方案为：一种生产酪醇的酵母，将来源于香芹(Petroselinumcrispum)的酪氨酸脱羧酶PcAAS(TryDC,Tyrosinedecarboxylase)和来源于肠杆菌属(Enterobacteriaceae)的醇脱氢酶(ADH，Alcoholdehydrogenase)的DNA序列导入酵母BY4741，得到PcAAS-ADH重组酵母。优选的，酪氨酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQIDNO.1；酪氨酸脱羧酶的DNA序列为SEQIDNO.2，能够表达SEQIDNO.1所示氨基酸序列。优选的，醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQIDNO.3；醇脱氢酶的DNA序列为SEQIDNO.4，能够表达SEQIDNO.3所示氨基酸序列。优选的，在所述PcAAS-ADH重组酵母中导入pdc1基因敲除盒，得到PcAAS-ADH-Δpdc1重组酵母。进一步优选的，所述pdc1基因敲除盒的构建方法，具体步骤为：以酵母BY4741的基因组为模板，利用引物分别扩增pdc1片段的上下游500bp同源臂，利用引物扩增G418抗性基因片段，将所述上下游500bp同源臂和G418抗性基因片段融合得到pdc1敲除盒。优选的，在所述PcAAS-ADH-Δpdc1重组酵母中导入tyrA表达盒，得到PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA重组酵母。进一步优选的，所述tyrA表达盒的构建方法，具体步骤为：以酵母BY4741的基因组为模板，利用引物扩增上游500bp的同源臂，以所述pdc1敲除盒为模板，利用引物扩增tyrA片段，将上游500bp的同源臂和tyrA片段融合构建tyrA表达盒。一种生产羟基酪醇的酵母，将来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的4-羟基苯乙酸羟化酶(HpaBC，4-hydroxyphenylacetichydroxylase)的DNA序列基因簇导入所述生产酪醇的PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA重组酵母中，得到生产羟基酪醇的PcAAS-ADH-HpaBC-Δpdc1-tyrA重组酵母。优选的，所述4-羟基苯乙酸羟化酶的氨基酸序列基因簇包括4-羟基苯乙酸羟化酶(HpaB)的氨基酸序列为SEQIDNO.5，4-羟基苯乙酸羟化酶(HpaC)的氨基酸序列为SEQIDNO.7。优选的，4-羟基苯乙酸羟化酶(HpaB)的DNA序列为SEQIDNO.6，能够表达SEQIDNO.5所示氨基酸序列；4-羟基苯乙酸羟化酶(HpaC)的DNA序列为SEQIDNO.8，能够表达SEQIDNO.7所示氨基酸序列。一种生产酪醇的酵母的构建方法，具体步骤为：1)将PcAAS和ADH的DNA序列插入表达载体，构建载体-PcAAS-ADH重组表达质粒；2)以酵母BY4741的基因组为模板，利用引物分别扩增pdc1片段的上下游500bp同源臂，利用引物扩增G418抗性基因片段，将所得片段融合得到pdc1敲除盒；3)以酵母BY4741的基因组为模板，利用引物扩增上游500bp的同源臂，以pdc1敲除盒为模板，利用引物扩增tyrA片段，将所得片段融合构建tyrA表达盒；4)将步骤2)得到的pdc1敲除盒和步骤3)得到的tyrA表达盒插入到步骤1)得到的载体-PcAAS-ADH质粒，得到PcAAS-A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产酪醇的酵母，其特征在于：具体步骤为：将来源于香芹的酪氨酸脱羧酶和来源于肠杆菌属的醇脱氢酶的DNA序列导入酵母BY4741，得到PcAAS‑ADH重组酵母。

【技术特征摘要】
1.一种生产酪醇的酵母，其特征在于：具体步骤为：将来源于香芹的酪氨酸脱羧酶和来源于肠杆菌属的醇脱氢酶的DNA序列导入酵母BY4741，得到PcAAS-ADH重组酵母。2.根据权利要求1所述生产酪醇的酵母，其特征在于：酪氨酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQIDNO.1；酪氨酸脱羧酶的DNA序列为SEQIDNO.2，能够表达SEQIDNO.1所示氨基酸序列；醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQIDNO.3；醇脱氢酶的DNA序列为SEQIDNO.4，能够表达SEQIDNO.3所示氨基酸序列。3.根据权利要求1所述生产酪醇的酵母，其特征在于：在权利要求1所述PcAAS-ADH重组酵母中导入pdc1基因敲除盒，得到PcAAS-ADH-pdc1重组酵母；所述pdc1基因敲除盒的构建方法，具体步骤为：以酵母BY4741的基因组为模板，利用引物分别扩增pdc1片段的上下游500bp同源臂，利用引物扩增G418抗性基因片段，将所述上下游500bp同源臂和G418抗性基因片段融合得到pdc1敲除盒。4.根据权利要求3所述的生产酪醇的酵母，其特征在于：在权利要求3所述PcAAS-ADH-Δpdc1重组酵母中导入tyrA表达盒，得到PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA重组酵母；所述tyrA表达盒的构建方法，具体步骤为：以酵母BY4741的基因组为模板，利用引物扩增上游500bp的同源臂，以权利要求4所述pdc1敲除盒为模板，利用引物扩增tyrA片段，将上游500bp的同源臂和tyrA片段融合构建tyrA表达盒。5.一种生产羟基酪醇的酵母，其特征在于：将来源于大肠杆菌的4-羟基苯乙酸羟化酶的DNA序列基因簇导入权利要求5所述PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA重组酵母中，得到生产羟基酪醇的PcAAS-ADH-HpaBC-Δpdc1-tyrA重组酵母。6.根据权利要求7所述的生产羟基酪醇的酵母，其特征在于：所述4-羟...

【专利技术属性】
技术研发人员：方诩，郭伟，韩丽娟，
申请(专利权)人：山东恒鲁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37