一种生产低温甾醇酯酶的菌株及其发酵方法技术

本发明专利技术涉及微生物学、生物化学及发酵工程等领域，是一种生产低温甾醇酯酶的菌株，命名为Q‑06，该菌株来自对原始菌株Pseudomonas fragi低温驯化。本发明专利技术的生产低温甾醇酯酶的菌株Q‑06生产低温甾醇酯酶最适温度为18‑24℃，无需加热/冷却等耗能即可制得低温甾醇酯酶，降低生产成本，满足工业生产需求；本发明专利技术的生产低温甾醇酯酶的菌株Q‑06具有生产甾醇酯酶的能力，该菌能高效地产生稳定的低温甾醇酯酶。

A strain producing low temperature sterol esterase and its fermentation method

The present invention relates to the fields of microbiology, biochemistry and fermentation engineering. It is a strain producing low-temperature sterol esterase, named Q 06. The strain comes from low-temperature domestication of the original strain Pseudomonas fragi. The optimum temperature for producing low-temperature sterol esterase by the strain Q_06 of the invention is 18_24 (?) C, and the low-temperature sterol esterase can be prepared without heating/cooling and other energy consumption, thus reducing production cost and meeting the needs of industrial production. The strain Q_06 of the invention for producing low-temperature sterol esterase has the ability to produce sterol esterase. The bacterium can produce stable sterol esterase efficiently.

【技术实现步骤摘要】
一种生产低温甾醇酯酶的菌株及其发酵方法
本专利技术涉及微生物学、生物化学及发酵工程等领域，具体涉及对一株莓实假单胞菌进行低温驯化，并利用新的低温菌株发酵获得甾醇酯酶的方法。
技术介绍
甾醇酯酶（Sterolesterase，EC3.1.1.13）是一种酯类水解酶，它能催化甾醇酯水解生成甾醇和脂肪酸，在适宜条件下也可通过酯化或酯交换反应催化甾醇酯合成。甾醇酯酶可帮助机体消化吸收油脂类营养物质，因其与人体脂质代谢及胆固醇吸收有关，甾醇酯酶是检测血液中总胆固醇含量的重要酶制剂之一。在造纸工业中，可利用甾醇酯酶与脂肪酶结合使用的方法，有效水解木材甾醇酯，改善纸张生产过程中的“树脂障碍”问题。目前，对微生物发酵生产甾醇酯酶的研究主要集中在甾醇酯酶高产菌株的分离鉴定、诱变育种、甾醇酯酶的分离纯化以及在工程菌中克隆表达阶段，其中均为中高温甾醇酯酶。而低温甾醇酯酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，因此，在工业化生产中具有节约能源的优势；经过温和的热处理即可使低温酶丧失活力，而低温或适温处理不会影响产品的品质。低温甾醇酯酶的应用将对传统的食品、医药等领域产生深远的影响。目前国内外还未见海洋微生物发酵生产低温甾醇酯酶的研究报道，如若海洋微生物发酵甾醇酯酶实现工业化生产则可创造良好的经济效益和社会效益。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种低温莓实假单胞菌即一种生产低温甾醇酯酶的菌株，并提供了其发酵生产甾醇酯酶的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种生产低温甾醇酯酶的菌株，命名为Q-06，该菌株来自对原始菌株Pseudomonasfragi（CGMCCNO.1.3349）低温驯化，申请人已针对菌株Q-06发展了一套培养技术，能从该菌稳定发酵生产低温甾醇酯酶。所述生产低温甾醇酯酶的菌株生物化学特征为：菌落形态特征为：在甾醇酯培养基上生长良好，菌株Q-06的单菌落近似圆形，边缘整齐，表面隆起，呈淡黄色，不透明，用接种环易于挑取，中心有光泽；菌体形态特征为：菌株呈杆状，多为单个排列，革兰氏染色结果呈阴性；主要生理生化特征：氧化酶试验、接触酶试验呈阳性，能够氧化分解葡萄糖，能够生成吲哚乙酸，不能生成硫化氢，不能水解淀粉，硝酸盐还原试验、伏普（VP）试验、甲基红（MR）试验、明胶水解试验均呈阴性，精氨酸双水解酶试验呈阳性反应；遗传学特征：所述的甾醇酯酶生产菌株Q-06进行序列鉴定，PCR扩增产物序列长度为1489bp。本专利技术所述的一种海洋微生物发酵生产低温甾醇酯酶的方法具体包括以下步骤:1）对菌株Pseudomonasfragi进行低温驯化得到菌株Q-06，驯化温度由高到低为：30℃→28℃→26℃→24℃→22℃→20℃→18℃，使其在低温环境中生长良好；2）将1）低温驯化得到的菌株接种于固体种子培养基上，在18～24℃培养48-96小时；3）按常规方法将低温驯化后的菌株用于生产甾醇酯酶。在18~24℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；4）将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的5～10%接种量接入液体发酵培养基中，在18~24℃培养48～120h时，即海洋微生物发酵生产低温甾醇酯酶结束；5）将4）的发酵液在8,000～12,000rpm离心收集上清液，收集到的液体即为粗酶液；6）根据不同需要和使用对象不同，将5）得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。具体的，步骤1）中驯化所用的低温驯化培养基为：植物甾醇酯10.0~30.0g，酵母粉5.0~10.0g，KH2PO42.0~5.0g，MgSO4·7H2O0.5~1.5g，(NH4)2SO41.0~3.0g，葡萄糖5.0~15.0g，琼脂粉18.0~20.0g，自来水1.0L，pH值6.0~8.0，于0.1MPa、121℃高压蒸汽灭菌30min；步骤2）所用固体种子培养基为：酵母膏5.0~10.0g，蛋白胨3.0g~5.0g，NaCl5.0~7.0g，K2HPO41.0~3.0g，FeSO4·7H2O0.05~0.1g，MgSO4·7H2O0.1~0.3g，琼脂粉18.0~20.0g，自来水1.0L，pH值6.0~8.0，于0.1MPa、121℃高压蒸汽灭菌30min；步骤3）培养所用液体种子培养基为：酵母膏5.0~10.0g，蛋白胨3.0g~5.0g，NaCl5.0~7.0g，K2HPO41.0~3.0g，FeSO4·7H2O0.05~0.1g，MgSO4·7H2O0.1~0.3g，自来水1.0L，pH值6.0~8.0，于0.1MPa、121℃高压蒸汽灭菌30min。步骤4）所用发酵产酶培养基为：植物甾醇酯5.0~15.0g，酵母粉3.0~5.0g，KH2PO41.0~2.0g，MgSO4·7H2O0.3~0.5g，(NH4)2SO40.5~1.0g，葡萄糖5.0~10.0g，自来水1.0L，pH6.0~8.0，于0.1MPa、121℃高压蒸汽灭菌30min。按本专利技术产酶条件发酵生产低温甾醇酯酶，低温驯化后的菌株Q-06在4℃环境中可保存2个月，用10~25vt%甘油制成的菌悬液在-80℃条件下可以长期保藏。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的生产低温甾醇酯酶的菌株Q-06生产低温甾醇酯酶最适温度为18-24℃，无需加热/冷却等耗能即可制得低温甾醇酯酶，降低生产成本，满足工业生产需求；本专利技术的生产低温甾醇酯酶的菌株Q-06具有生产甾醇酯酶的能力，该菌能高效地产生稳定的低温甾醇酯酶；本专利技术生产低温甾醇酯酶的菌株发酵生产的低温甾醇酯酶用于在制备功能性降胆固醇食品、聚氨酯的生物降解、临床胆固醇测定试剂盒的制备等方面的研究，其在食品、医药、化工等领域都有着很广泛的应用价值。附图说明：图1甾醇酯酶生产菌Q-06的菌落形态；图2甾醇酯酶生产菌Q-06的菌体形态；图3甾醇酯酶生产菌Q-06的16SrDNAPCR扩增产物电泳图；图4甾醇酯酶生产菌的Q-06的16SrDNA序列系统发育树；图5甾醇酯酶粗酶液最适作用温度；图6甾醇酯酶粗酶液最适作用pH曲线。具体实施方式：实施例1低温甾醇酯酶生产菌Q-06的获得：1）原始菌株Pseudomonasfragi（CGMCCNO.1.3349）的活化：活化培养基为：胰蛋白胨8.0~10.0g，酵母粉4.0g~9.0g，NaCl8.0~10.0g，琼脂18.0~20.0g，自来水1.0L，pH值为6.0~8.0，于0.1MPa、121℃高压蒸汽灭菌30min。2）低温驯化：对1）的菌株进行低温驯化得到低温甾醇酯酶生产菌Q-06，驯化温度由高到低为：30℃→28℃→26℃→24℃→22℃→20℃→18℃，使其在低温环境中生长良好；所用低温驯化培养基为：植物甾醇酯10.0~30.0g，酵母粉5.0~10.0g，KH2PO42.0~5.0g，MgSO4·7H2O0.5~1.5g，(NH4)2SO41.0~3.0g，葡萄糖5.0~15.0，琼脂粉18~20.0g，自来水1.0L，pH值为7.0，于0.1MPa、121℃高压蒸汽灭菌30min。所用菌株Pseudomonasfragi购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCCNO.1.3349。实施例2低温甾醇酯酶生产菌Q-06的分离鉴定：菌落本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产低温甾醇酯酶的菌株，其特征在于，命名为Q‑06，该菌株来自对原始菌株Pseudomonas fragi低温驯化。

【技术特征摘要】
1.一种生产低温甾醇酯酶的菌株，其特征在于，命名为Q-06，该菌株来自对原始菌株Pseudomonasfragi低温驯化。2.如权利要求1所述的生产低温甾醇酯酶的菌株，其特征在于，菌落形态特征为：所述菌株在甾醇酯培养基上生长良好，单菌落近似圆形，边缘整齐，表面隆起，呈淡黄色，不透明，用接种环易于挑取，中心有光泽；菌体形态特征为：菌株呈杆状，多为单个排列，革兰氏染色结果呈阴性；主要生理生化特征：氧化酶试验、接触酶试验呈阳性，能够氧化分解葡萄糖，能够生成吲哚乙酸，不能生成硫化氢，不能水解淀粉，硝酸盐还原试验、伏普（VP）试验、甲基红（MR）试验、明胶水解试验均呈阴性，精氨酸双水解酶试验呈阳性反应；遗传学特征：所述低温甾醇酯酶生产菌Q-06，即PseudomonasfragiQ-06的16SrDNA全基因序列共1489bp。3.如权利要求1所述生产低温甾醇酯酶的菌株Q-06生产低温甾醇酯酶的发酵方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1）对菌株Pseudomonasfragi（CGMCCNO.1.3349）进行低温驯化得到菌株Q-06，驯化温度由高到低为：30℃→28℃→26℃→24℃→22℃→20℃→18℃；2）将1）低温驯化得到的菌株Q-06，接种于固体种子培养基用于生产甾醇酯酶，在18～24℃培养48-96小时；3）将低温菌株Q-06在18~24℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；4）将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的5～10%接种量接入液体发酵产酶培养基中，在18~24℃培养48～120h时，即海洋微生物发酵生产低温甾醇酯酶结束；5）将4）的发酵液在8,000～12,000rpm离心收集上清液，收集到的液体即为粗酶液。4.如权利要求4所述的生产低温甾醇酯酶的菌株Q-06生产...

【专利技术属性】
技术研发人员：张庆芳，任楠楠，王晓辉，迟乃玉，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21