一种产fusaruside工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及微生物以及医药技术领域，具体涉及一种产fusaruside工程菌及其构建方法与应用。本发明专利技术将源于禾谷镰刀菌中3位去饱和酶和10位去饱和酶在毕赤酵母中表达，构建了能够生产fusaruside的毕赤酵母菌株。与fusaruside原产菌株镰刀菌相比，该酵母菌的发酵时间更短，仅需5～7d，而镰刀菌一般需要10～14d。另外，本发明专利技术解决fusaruside在镰刀真菌中含量少的问题，产量较原产菌株提高了11.6倍，为fusaruside的进一步开发与应用奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种产fusaruside工程菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及微生物以及医药
，具体涉及一种产fusaruside工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
免疫抑制剂是治疗移植排斥反应和自身免疫疾病的主要药物。但是，目前临床常用的免疫抑制剂存在多种不良反应，长期服用会导致严重的副作用，这多与免疫抑制药物对靶点的选择性不高有关。因此，寻找新的免疫系统疾病治疗靶点以及开发针对这些靶点的高效、低毒、高选择性的新型小分子免疫抑制剂成为当务之急。最近的研究发现，新型脑苷脂类小分子化合物fusaruside具有良好的免疫抑制活性，其可特异性地抑制小鼠原代T细胞STAT1的活化，但不影响STAT3，4，5和6的活化，靶向效果较好。进一步研究发现，fusaruside可促进磷酸酶SHP-2的磷酸化，磷酸化的SHP-2可与胞浆中非磷酸化的STAT1选择性结合，从而选择性地阻断了IFN-γ/STAT1/T-bet的信号通路，进而发挥其选择性的免疫抑制作用，是临床用免疫抑制剂的潜力分子。然而，fusaruside化学结构复杂，通过化学合成的方法来获得，不仅操作困难、步骤繁琐，而且有毒化学试剂的使用还会严重污染环境。而在微生物领域，fusaruside存在于丝状真菌镰刀菌中，属于细胞构成物，含量甚微，200g镰刀菌粗提物中仅分得24mgfusaruside。这些因素严重制约了脑苷脂类免疫抑制剂的研究和应用。因此，亟待建立一种简单、廉价、高效、环保的fusaruside生产方法。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种产fusaruside工程菌及其构建方法与应用。本专利技术通过合成生物学技术，构建了能够生产fusaruside的毕赤酵母菌株。与fusaruside原产菌株镰刀菌相比，该酵母菌的发酵时间更短，仅需5～7d，而镰刀菌一般需要10～14d。另外，本专利技术解决fusaruside在镰刀真菌中含量少的问题，产量较原产菌株提高了11.6倍，为fusaruside的进一步开发与应用奠定基础。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供一种产fusaruside工程菌，将源于禾谷镰刀菌中3位去饱和酶和10位去饱和酶在毕赤酵母中表达。进一步的，所述3位去饱和酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述10位去饱和酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步的，所述3位去饱和酶的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述10位去饱和酶的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。目前，仅在丝状真菌镰刀菌属中发现有完整的fusaruside合成途径，并且本专利技术人在前期研究镰刀菌属fusaruside合成途径中首次发现了Δ10(E)-SD，并且证实Δ10(E)-SD可以催化cerebrosideB生成fusaruside。而在毕赤酵母中仅存在cerebrosideD合成途径，本专利技术首次实现了将源于禾谷镰刀菌的Δ3(E)-SD与Δ10(E)-SD在毕赤酵母中共表达，在较为复杂的毕赤酵母表达系统中，可有效实现Δ3(E)-SD催化cerebrosideD生成cerebrosideB，Δ10(E)-SD进一步催化cerebrosideB生成fusaruside，本专利技术在毕赤酵母表达系统中构建了完整的fusaruside合成途径，并且实现了fusaruside的大量合成，本专利技术构建的工程菌产fusaruside量较原产菌株提高了11.6倍，为fusaruside规模化生产奠定了基础。本专利技术目的之二，提供一种产fusaruside工程菌的构建方法，包括以下步骤：S1.扩增禾谷镰刀菌中3位去饱和酶和10位去饱和酶的基因；S2.设计引物，通过重叠延伸PCR保证目的氨基酸序列不改变的情况下，对步骤S13位去饱和酶和10位去饱和酶基因中含有的BamHI和EcoRI进行改造，使基因中不再包含这两种酶的酶切位点；改造后的3位去饱和酶核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；改造后的10位去饱和酶的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；S3.构建的重组表达载体，转化毕赤酵母，即得。进一步的，步骤S2所用引物为：3位去饱和酶：D3-F1：GCCACCATGGCCGAACACCTC，如SEQIDNO.5所示；D3-R1：AGTGAAGGATTCCATGTATCCATGAGAAATTG，如SEQIDNO.6所示；D3-F2：CAATTTCTCATGGATACATGGAATCCTTCACT，如SEQIDNO.7所示；D3-R2：GTGGCTCCGGACCCCTGCCTCTTAAACTTCT，如SEQIDNO.8所示；10位去饱和酶：D10-F1：GAAAACCCCGGTCCTATGGCGCATAGCTCTTT，如SEQIDNO.9所示；D10-R1：GCGATATATCGAAGGAACTCGATCCCATAGGCT，如SEQIDNO.10所示；D10-F2：AGCCTATGGGATCGAGTTCCTTCGATATATCGC，如SEQIDNO.11所示；D10-R2：CTAGTGATGAGAGAGATCACCA，如SEQIDNO.12所示。进一步的，步骤S3构建重组表达载体的方法为：利用巢式扩增PCR扩增改造后3位去饱和酶和10位去饱和酶基因，在两段基因片段之间插入2A肽基因，构成Δ3(E)-SD–2A–Δ10(E)-SD的组合基因片段，利用BamHI和EcoRI对组合基因片段和酵母表达载体pPIC3.5K进行双酶切，进行连接并转化到大肠杆菌中扩增，即得。进一步的，2A肽基因核苷酸序列如SEQIDNO.13所示。为了提高Δ3(E)-SD、Δ10(E)-SD的表达效率，本专利技术以pPIC3.5K为表达载体，并且在Δ3(E)-SD、Δ10(E)-SD两片段基因之间插入2A肽基因，确保了Δ3(E)-SD、Δ10(E)-SD两片段基因的表达平衡，使Δ3(E)-SD、Δ10(E)-SD在毕赤酵母细胞内具有活性，并且能够催化cerebrosideD生成cerebrosideB，并进一步生成fusaruside。本专利技术目的之三，提供所述产fusaruside工程菌在产fusaruside中的应用。本专利技术目的之四，提供一种fusaruside的生产方法，将以上所述产fusaruside基因工程菌接种于MGY培养基中培养，将培养物接种于MGY培养基中培养至对数期，1500～3000g离心5-10min收集细胞，用MM重悬细胞至OD600＝1.0，加入甲醇进行诱导表达，即得。进一步的，加入甲醇体积浓度为0.5％。本专利技术取得的技术效果：(1)本专利技术首次实现了fusaruside在毕赤酵母中大量合成，本专利技术构建得到的毕赤酵母工程菌产fusaruside，较原产菌株提高了11.6倍，使fusaruside的大量获得成为可能。(2)本专利技术产fusaruside工程菌产fusaruside所需发酵周期短，仅需5～7d，而镰刀菌一般需要10～14d，因而大大缩短了fusaruside生产周期。(3)本专利技术生产fusaruside的方法简单、廉价、高效、环保，有利于fusaruside的工业化生产。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产fusaruside工程菌，其特征在于，将源于禾谷镰刀菌中3位去饱和酶和10位去饱和酶在毕赤酵母中表达。

【技术特征摘要】
1.一种产fusaruside工程菌，其特征在于，将源于禾谷镰刀菌中3位去饱和酶和10位去饱和酶在毕赤酵母中表达。2.如权利要求1所述工程菌，其特征在于，所述3位去饱和酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述10位去饱和酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.如权利要求1所述工程菌，其特征在于，所述3位去饱和酶的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述10位去饱和酶的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。4.权利要求1所述产fusaruside工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.扩增禾谷镰刀菌中3位去饱和酶和10位去饱和酶的基因；S2.设计引物，通过重叠延伸PCR保证目的氨基酸序列不改变的情况下，对步骤S13位去饱和酶和10位去饱和酶基因中含有的BamHI和EcoRI进行改造，使基因中不再包含这两种酶的酶切位点；改造后的3位去饱和酶核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；改造后的10位去饱和酶的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；S3.构建的重组表达载体，转化毕赤酵母，即得。5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤S2所用引物为：3位去饱和酶：D3-F1：GCCACCATGGCCGAACACCTC，如SEQIDNO.5所示；D3-R1：AGTGAAGGATTCCATGTATCCATGAGAAATTG，如SEQIDNO.6所示；D3-F2：CAATTTCTCATGGATACATGGAATCCTTCACT，如SEQIDNO.7所示；D3-R2：GTGGCTCCGGACCCCTGCCTCTTAAACT...

【专利技术属性】
技术研发人员：田园，李艳玲，
申请(专利权)人：泰山医学院，
类型：发明
国别省市：山东,37