获得丧失遗传干涉的水稻突变体的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种获得丧失遗传干涉的水稻突变体的方法及其应用。其中，该方法包括以下步骤：采用基因工程手段使ZEP1蛋白的前350个氨基酸不表达或者蛋白活性/功能丧失。应用本发明专利技术的技术方案，改造水稻ZEP1基因，改造后的植株雄性不育，雌性可育，改造后的水稻植株可用于杂交育种，由于经过改造的水稻细胞核不育，当其用于育种时，不需要配套的保持系，又因为改造之后的水稻的遗传干涉丧失，也可以用作育种的中间材料，加快染色体片段的交换，提高育种效率。

【技术实现步骤摘要】
获得丧失遗传干涉的水稻突变体的方法及其应用
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种获得丧失遗传干涉的水稻突变体的方法及其应用。
技术介绍
1916年，Muller在研究果蝇的遗传规律时发现染色体上一次交换降低了邻近区间再次发生交换的概率，这种现象被他命名为遗传干涉。经过百余年的研究发现，除了极少数生物如裂殖酵母、兰绿藻以外，遗传干涉现象普遍存在于真核生物中。由于遗传干涉的存在，染色体上发生双交换的物理距离通常较大，同一条染色体上的基因偏向于连锁遗传，染色体的遗传物质的交流也因此而受到严格的控制，出现新的基因组合个体的频率低。如果能找到一种遗传干涉丧失的突变体，那么就会增加亲本间的遗传物质的交流机会。如果将这种材料用于育种，就会提高育种效率，缩短育种周期，节省人力成本。Wang等从Tos17突变体库中筛选到4个ZEP1基因突变体，其中两个突变体的突变位点位于第8外显子的末尾，位置均在CDS序列的1150bp(对应于第384个氨基酸)之后，另两个突变体的突变位点分别位于第12外显子和12内含子上，按照突变位置的先后顺序分别命名为zep1-1，zep1-2，zep1-3，zep1-4。对zep1-1的研究发现，其育性降低到野生型的32％左右，其重组频率提高。对zep1-3的研究发现，其育性大约为野生型的48％左右，其遗传重组频率提高，遗传干涉强度降低到野生型的20-30％之间。目前作物育种大多数通过杂交育种(种内杂交或者种间杂交)进行，需要经过多代杂交或者回交使遗传物质进行充分的交流，才能筛选到符合预期的目的植株。遗传物质的交换是作物遗传育种的基础，由于遗传干涉的存在，限制了遗传物质的交换，因此阻碍了育种前进的步伐，但是到目前为止也没有利用遗传干涉丧失的突变体材料来提高育种效率的先例。水稻三系杂交育种的不育系通常是细胞质雄性不育，属于核质互作型，需要配套的保持系和恢复系，不育系的繁种和杂交种的制备过程是分开的，操作复杂，耗费人力大。如果用细胞核不育的材料作为不育系，将不需要配套的保持系，因此会简化育种的过程。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种获得丧失遗传干涉的水稻突变体的方法及其应用，以解决现有技术中水稻杂交育种操作复杂的技术问题以及加快水稻染色体片段的代换。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种获得丧失遗传干涉的水稻突变体的方法。该方法包括以下步骤：采用基因工程手段使ZEP1蛋白的前350个氨基酸不表达或者蛋白活性/功能丧失。进一步地，采用CRISPR-Cas9、ZFN、TALEN或CRISPR-cpf1基因编辑工具使ZEP1蛋白的前350个氨基酸不表达或者蛋白活性/功能丧失。进一步地，采用移码突变手段使ZEP1蛋白的前350个氨基酸不表达或者蛋白活性/功能丧失。进一步地，采用CRISPR-Cas9对水稻的联会复合体基因ZEP1进行基因编辑，编辑位点位于ATG起始密码子下游第37bp处。进一步地，采用RNA干扰ZEP1蛋白的表达。根据本专利技术的另一方面，提供了一种上述任一种方法获得的丧失遗传干涉的水稻突变体在杂交育种中的应用。进一步地，丧失遗传干涉的水稻突变体为细胞核不育，用于育种时，不需要配套的保持系。应用本专利技术的技术方案，改造水稻ZEP1基因，改造后的植株雄性不育，雌性可育。当将改造该基因之后的水稻材料用作杂交育种的不育系时，由于它的细胞核不育的特性，不需要配套的保持系，简化了育种过程。通过基因工程改造该基因之后的水稻植株遗传干涉丧失，可以用作育种的中间材料，加快染色体片段的交换，提高育种效率。因此，通过对水稻联会复合体基因ZEP1进行遗传改良，所获得的遗传干涉丧失的水稻突变体植株，既可以用作杂交育种的不育系母本，也可以用作育种的中间材料。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1中A-G示出了实施例1中突变体植株表型观察及杂交；图2中A-D示出了实施例2中突变体植株表型观察。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。针对现有技术中水稻三系杂交育种需要配套的保持系和恢复系，操作复杂，耗费人力等技术问题，本专利技术的专利技术人提出了以下专利技术构思及技术方案。研究表明zep1弱突变体的雌雄配子均有育性，因此无法用作三系杂交育种的不育系。并且其遗传干涉强度只是轻微降低，而没有丧失。本专利技术的专利技术人希望通过基因工程手段获得丧失遗传干涉的水稻突变体。该丧失遗传干涉的水稻突变体如果雄性不育、雌性可育，那么改造的突变体可用于杂交育种，由于是细胞核不育，在用作育种材料时，不需要配套的保持系，降低操作的复杂性，减少人力耗费。根据本专利技术一种典型的实施方式，提供一种获得丧失遗传干涉的水稻突变体的方法。该方法包括以下步骤：采用基因工程手段使ZEP1蛋白的前350个氨基酸不表达或者蛋白活性/功能丧失。应用本专利技术的技术方案，改造水稻ZEP1基因，使改造后的植株雄性不育、雌性可育。改造该基因之后的育种材料用于杂交育种，由于是细胞核不育，因此不需要配套的保持系。通过基因工程改造该基因之后的育种材料的遗传干涉丧失，可以用作育种的中间材料，加快染色体片段的交换，提高育种效率。通过对水稻联会复合体基因ZEP1进行遗传改良，获得花粉不育雌配子可育以及遗传干涉丧失的水稻突变体植株，该水稻植株既可以用作杂交育种的不育系母本，也可以用作育种的中间材料。根据本专利技术一种典型的实施方式，采用CRISPR-Cas9、ZFN、TALEN或CRISPR-cpf1等基因编辑工具使ZEP1蛋白的前350个氨基酸不表达或者蛋白活性/功能丧失。优选的，选用CRISPR-Cas9技术，该技术比较成熟，操作方便。另外，还可以采用RNAi等方法干扰ZEP1蛋白的表达实现上述目的，除RNA干扰之外的抑制蛋白表达或者抑制蛋白活性的方法，如表达后进行蛋白修饰等均能达到同样的效果。根据本专利技术一种典型的实施方式，采用移码突变手段使ZEP1蛋白的前350个氨基酸不表达或者蛋白活性/功能丧失。优选的，采用CRISPR-Cas9对水稻的联会复合体基因ZEP1进行基因编辑，编辑位点位于ATG起始密码子下游第37bp处，发生移码突变，只要插入或缺失碱基数为非3倍数，使阅读框发生改变即可。又如，前20bp进行突变。理论来说CDS序列的前1050bp突变均可获得丧失遗传干涉的水稻突变体。根据本专利技术一种典型的实施方式，提供一种采用上述任一种方法获得的丧失遗传干涉的水稻突变体在杂交育种中的应用。优选的，丧失遗传干涉的水稻突变体为细胞核不育，不需要配套的保持系下面将结合实施例进一步说明本专利技术的有益效果。实施例1具体操作步骤如下：1、基因敲除载体的构建按照CRISPR-Cas9系统对靶序列的要求(PAM(ProtospacerAdjacentMotif)为NGG，序列长度为22bp)，在ZEP1基因序列上选择特异的靶序列，并根据gRNA引物设计原则，在F向引物和R向引物两端加上酶切连接碱基，设计好的引物命名为ZEP1-gRNA-F/ZEP1-gRNA-R。ZEP1-gRNA-F具有如下序列：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种获得丧失遗传干涉的水稻突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用基因工程手段使ZEP1蛋白的前350个氨基酸不表达或者蛋白活性/功能丧失。

【技术特征摘要】
1.一种获得丧失遗传干涉的水稻突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用基因工程手段使ZEP1蛋白的前350个氨基酸不表达或者蛋白活性/功能丧失。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用CRISPR-Cas9、ZFN、TALEN或CRISPR-cpf1基因编辑工具使ZEP1蛋白的前350个氨基酸不表达或者蛋白活性/功能丧失。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用移码突变手段使ZEP1蛋白的前350个氨基酸不表达或者蛋白活性/功能丧失...

【专利技术属性】
技术研发人员：王克剑，华宇峰，刘庆，王春，
申请(专利权)人：中国水稻研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33