一种用于DNA建库的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于DNA建库的试剂盒及其应用，特别涉及用于外周血cfDNA建库的试剂盒及其应用。本发明专利技术首先提供了一种用于DNA建库的试剂盒，包括组件甲和组件乙；组件甲包括配比如下的各个组分：1‑3U T4 PNK：1‑4.5U Klenow Fragment：0.25‑0.5U LA Taq DNA Polymerase：0.3‑0.9U T4 DNA Polymerase：0.5‑2.5nmol dNTP：0.5‑2.5nmol dATP；组件乙包括配比如下的各个组分：2.5‑8nmol ATP：26.5‑132U T4 DNA Ligase：0.213μL‑0.534μLPEG 8000。本发明专利技术提供的试剂盒及其应用方法，尽可能减少了建库过程中DNA损失，减少了血浆使用量，降低了建库成本，缩短了建库时间，操作更简便，结果更稳定可靠。本发明专利技术对于提高建库效率，减少人力成本有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种用于DNA建库的试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种用于DNA建库的试剂盒及其应用，特别涉及用于外周血cfDNA建库的试剂盒及其应用。
技术介绍
外周血游离DNA是存在于外周血循环中的游离DNA(cell-freeDNA，cfDNA)。cfDNA的来源主要有如下两种：第一种，细胞凋亡过程中产生的“DNAladder”式的片段化核酸，大小基本上在150-200bp；第二种，细胞被裂解(这种裂解既可以来源于物理性刺激引发的坏死，也可以是免疫细胞杀伤作用)产生的核酸，大小接近基因组DNA。当然，不管是哪种方式产生的cfDNA，都会进一步在外周血中被快速清除(这个时间可能是数十分钟至数小时不等，但机制尚不清楚)。与健康人相比，肿瘤患者cfDNA含量升高，这些cfDNA可以来自肿瘤原发灶、转移灶、循环肿瘤细胞以及正常组织。目前学者们普遍认为，在肿瘤发生发展的早期阶段即有核酸释放入血，并将这种循环在血液中的肿瘤细胞DNA命名为ctDNA(CirculatingtumorDNA)，这些ctDNA被认为携带了肿瘤组织遗传学和表观遗传学的变异信息。近年来，随着技术手段的迅速发展，ctDNA作为一种可广泛应用的生物标志物被越来越多地关注和报道。有研究已经证实了利用癌症患者ctDNA结合新一代高通量测序技术在肿瘤个体化治疗上的可行性，并指明了ctDNA在肿瘤早期诊断、个体化治疗和预后监测等方面的巨大潜力和应用前景。目前市场上能够有效进行DNA建库的试剂盒主要有两种，均为KAPABiosystems公司的产品，一种是KAPA-LTP试剂盒，另一种是KAPA-Hyper试剂盒。KAPA-LTP试剂盒的工作原理流程示意图见图1。该试剂盒采用三步法建库，将末端修复、末端加A和接头连接三个步骤分开反应，流程较稳定，可以针对基因组DNA、血浆DNA以及福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)DNA，各样本间的成功率和效果差异较大。但是，应用KAPA-LTP试剂盒进行DNA建库，存在单个建库成本过高、建库产量低、耗时长、操作复杂等不利于生产的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于DNA建库的试剂盒及其应用，特别涉及用于外周血cfDNA建库的试剂盒及其应用。本专利技术首先提供了一种用于DNA建库的试剂盒，包括组件甲和组件乙；组件甲包括配比如下的各个组分：1-3UT4PNK：1-4.5UKlenowFragment：0.25-0.5ULATaqDNAPolymerase：0.3-0.9UT4DNAPolymerase：0.5-2.5nmoldNTP：0.5-2.5nmoldATP；组件乙包括配比如下的各个组分：2.5-8nmolATP：26.5-132UT4DNALigase：0.213μL-0.534μLPEG8000。组件甲优选包括配比如下的各个组分：2UT4PNK：3UKlenowFragment：0.25ULATaqDNAPolymerase：0.6UT4DNAPolymerase：1.25nmoldNTP：1nmoldATP。组件乙优选包括配比如下的各个组分：5.6nmolATP：85UT4DNALigase：0.267μLPEG8000。组件甲中，dATP指的是dNTP以外额外加入的dATP。组件甲中的各个组分，可以混合包装，也可以单独包装待使用时再混合。组件乙中的各个组分，可以混合包装，也可以单独包装待使用时再混合。组件甲具体可为5×FastLibraryRepaireMix1。5×FastLibraryRepaireMix1中，包括1-3U/μLT4PNK、1-4.5U/μLKlenowFragment、0.25-0.5U/μLLATaqDNAPolymerase、0.3-0.9U/μLT4DNAPolymerase、0.5-2.5nmol/μLdNTP、0.5-2.5nmol/μLdATP。5×FastLibraryRepaireMix1中，优选包括2U/μLT4PNK、3U/μLKlenowFragment、0.25U/μLLATaqDNAPolymerase、0.6U/μLT4DNAPolymerase、1.25nmol/μLdNTP、1nmol/μLdATP。5×FastLibraryRepaireMix1中，包括1-3U/μLT4PNK、1-4.5U/μLKlenowFragment、0.25-0.5U/μLLATaqDNAPolymerase、0.3-0.9U/μLT4DNAPolymerase、0.5-2.5nmol/μLdNTP、0.5-2.5nmol/μLdATP和50％(体积百分含量)10×T4PNKbuffer，余量为水。5×FastLibraryRepaireMix1中，优选包括2U/μLT4PNK、3U/μLKlenowFragment、0.25U/μLLATaqDNAPolymerase、0.6U/μLT4DNAPolymerase、1.25nmol/μLdNTP、1nmol/μLdATP和50％(体积百分含量)10×T4PNKbuffer，余量为水。组件乙具体可为AdaptorLigationMix2。所述试剂盒中还可包括组件丙。组件丙为接头。接头(Adaptor)具体可为将单链DNA分子HS-PEIA-1.1和单链DNA分子HS-PEIA-1.2退火得到的DNA分子。HS-PEIA-1.1如序列表的序列1所示；HS-PEIA-1.2如序列表的序列2所示。AdaptorLigationMix2、组件丙和水(具体为ddH2O)组成30μL体系。该30μL体系中，ATP的浓度为2.5-8nmol/μL、T4DNALigase的浓度为26.5-132U/μL、PEG8000的浓度为21.3％-53.4％(体积百分含量)。该30μL体系中，组件丙的浓度为0.6-3μM。该30μL体系中，ATP的浓度优选为5.6nmol/μL、T4DNALigase的浓度优选为85U/μL、PEG8000的浓度优选为26.7％(体积百分含量)。该30μL体系中，组件丙的浓度优选为0.67μM。该30μL体系中，ATP的浓度为2.5-8nmol/μL、T4DNALigase的浓度为26.5-132U/μL、PEG8000的浓度为21.3％-53.4％(体积百分含量)、10×T4PNKBuffer的浓度为10％(体积百分含量)，组件丙的浓度为0.6-3μM，余量为水。该30μL体系中，ATP的浓度优选为5.6nmol/μL、T4DNALigase的浓度优选为85U/μL、PEG8000的浓度优选为26.7％(体积百分含量)、10×T4PNKBuffer的浓度为10％(体积百分含量)，组件丙的浓度优选为0.67μM，余量为水。所述组件甲为溶液形式，溶剂为T4PNKbuffer或T4PNKbuffer的浓缩液。所述组件乙为溶液形式，溶剂为T4PNKbuffer或T4PNKbuffer的浓缩液。所述试剂盒还包括组件丁；所述组件丁包括标签和引物。优选地，所述标签为单链标签，所述引物为单链引物。所述引物为测序引物。所述标签具体可为IndexN。IndexN如序列表的序列3所示。IndexN中，N代表A/T/C/G四个碱基中的任意本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于DNA建库的试剂盒，包括组件甲和组件乙；组件甲包括配比如下的各个组分：1‑3U T4PNK：1‑4.5U Klenow Fragment：0.25‑0.5U LA Taq DNA Polymerase：0.3‑0.9U T4DNA Polymerase：0.5‑2.5nmol dNTP：0.5‑2.5nmol dATP；组件乙包括配比如下的各个组分：2.5‑8nmol ATP：26.5‑132U T4DNA Ligase：0.213μL‑0.534μLPEG 8000。

【技术特征摘要】
1.一种用于DNA建库的试剂盒，包括组件甲和组件乙；组件甲包括配比如下的各个组分：1-3UT4PNK：1-4.5UKlenowFragment：0.25-0.5ULATaqDNAPolymerase：0.3-0.9UT4DNAPolymerase：0.5-2.5nmoldNTP：0.5-2.5nmoldATP；组件乙包括配比如下的各个组分：2.5-8nmolATP：26.5-132UT4DNALigase：0.213μL-0.534μLPEG8000。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：组件甲包括配比如下的各个组分：2UT4PNK：3UKlenowFragment：0.25ULATaqDNAPolymerase：0.6UT4DNAPolymerase：1.25nmoldNTP：1nmoldATP；组件乙包括配比如下的各个组分：5.6nmolATP：85UT4DNALigase：0.267μLPEG8000。3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括组件丙；组件丙为接头。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述接头为将单链DNA分子HS-PEIA-1.1和单链DNA分子HS-PEIA-1.2退火得到的DNA分子；HS-PEIA-1.1如序列表的序列1所示；HS-PEIA-1.2如序列表的序列2所示。5.如权利要求1至4中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括组件丁；所述组件丁包括标签和引物；任选地，所述标签为单链标签，所述引物为单链引物。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述标签为IndexN；IndexN如序列表的序列3所示；任选地，所述引物为indexP1；indexP1如序列表的序列4所示；任选地，所述试剂盒还包括组件戊；组件戊为用于纯化DNA的物质；任选地，所述组件戊为AgencourtAMPureXPReagent。7.权利要求1至6中任一所述试剂盒在DNA建库中的应用；任选地，所述DNA建库为构建外周血游离DNA的文库或构建ctDNA的文库。8.一种构建DNA文库的方法，包括如下步骤：(1)将含有目标核酸的溶液作为模板，进行末端修复和加A反应；初始反应体系由模板、T4PNK、KlenowFragm...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘军，赵强，王玉秋，朱红梅，茅矛，叶明芝，魏汉敏，席阳，安德烈·阿莱克谢耶夫，
申请(专利权)人：天津华大医学检验所有限公司，深圳华大基因股份有限公司，广州华大基因医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12