一种水稻DNA的简易提取方法技术

本发明专利技术提供了一种水稻DNA的简易提取方法，包括：将剪碎的叶片在研磨仪上震荡研磨，加入氯仿颠倒混匀后离心至分相，取上清加入冰无水乙醇，离心至沉淀附于离心管底部，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀，自然干燥，用1/10×TE缓冲液溶解沉淀，保存备用。本发明专利技术方法提取的DNA具有产率高、质量好、成本低且较为安全等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种水稻DNA的简易提取方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种水稻DNA的简易提取方法。
技术介绍
水稻是世界上最主要的三大粮食作物之一，有着丰富和深入的基因组研究基础，其中DNA的制备是深入进行分子生物学研究的基础。基于PCR分子标记技术已经广泛应用于基因定位、基因克隆、转基因植株检测及分子标记辅助育种等方面，这些研究都需要进行大量DNA提取工作。然而，DNA提取是一项耗费人力、物力的繁琐工作。因此，建立适合PCR分析的简便、高效、低成本且较为相安全的DNA提取方法是非常必要的。前人已就植物基因组DNA的提取总结了一系列的方法，如SDS法和CTAB法，虽然这些方法抽提的DNA质量较好，但过程费力且繁琐，需要使用氯仿、异戊醇等有毒化学试剂，难以适用于大量植物叶片基因组DNA提取的需要。相应地，一些生物公司也开了一些基因组DNA提取试剂盒，但试剂盒提取DNA成本较高，也不适用于大量样品DNA的提取。
技术实现思路
为了解决上述问题，实现高通量提取水稻DNA，满足各种PCR分子标记技术的要求，本专利技术提供了一种简单、快速的提取植物DNA的方法。本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种水稻DNA的简易提取方法，包括以下步骤：1)从水稻幼苗上剪取叶片并剪成碎片，放入离心管中；2)加入小钢珠和DNA提取液，在Tissuelyser-192组织研磨仪上震荡研磨；3)加入氯仿颠倒混匀，静置后，离心至清晰分相，吸取上清液转入新的离心管中，弃枪头；4)加入在-20℃冰箱预冷的无水乙醇，颠倒混匀；5)离心至沉淀附于离心管底部，弃上清液，用乙醇洗涤沉淀，将离心管倒置，自然干燥；6)加入1/10×TE缓冲液溶解沉淀，样品置于-20℃冰箱中保存备用。进一步，所述的震荡研磨具体为：在25Hz下震荡研磨60s。进一步，所述的步骤(4)中冰箱的温度条件为-20℃。进一步，所述的离心条件均为11000rpm。进一步，所述的洗涤沉淀用的乙醇浓度为70％。进一步，所述的DNA提取液为：10mL浓度为1M的Tris-HCl(pH8.0)、10mL浓度为0.5M的EDTA(pH8.0)、10mL浓度为5M的NaCl，最后利用ddH2O定容至100mL，配置新鲜溶液待用。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了一种操作简单的水稻DNA提取方法，该方法在提取过程中使用的试剂相比现有技术少，不仅降低了成本，还减少SDS和异戊醇等有毒有害试剂使用，提高实验人员的安全性，且提取得到的DNA具有很长的保存时间，不易降解，同时提高了水稻DNA的提取效率。附图说明图1是SSR标记RM303检测协青早B(XB)和196个协青早B与东乡野生稻BC2F5株系基因型结果；图2是SSR标记RM128检测赣晚籼30号和长雄野生稻及其94个BC3F3衍生系及其亲本基因型结果；图3是SSR标记RM303检测协青早B(XB)和90个协青早B与东乡野生稻BC3F2株系基因型结果。具体实施方式下面将结合本专利技术具体的实施例，对本专利技术实技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术针对现有技术提取DNA的方法繁琐、成本高的缺点，提出了一种简易的快速提取水稻DNA的方法，具体如下：1)从水稻幼苗上剪取叶片2～3cm，剪成0.5cm长的碎片，放入2.0mL微量离心管中。如果从田间水稻植株上取叶片，需将叶片放于预先做好标记的密封塑料袋中，然后存放于冰上带回实验室，再将叶片剪碎放入2.0mL微量离心管中。2)加入小钢珠和450μLDNA提取液，在Tissuelyser-192组织研磨仪上25Hz震荡研磨60s。3)加入450μL氯仿，上下颠倒混匀，静置5分钟。氯仿(三氯甲烷)为腐蚀性试剂，需要带一次性PE手套在通风橱中操作。4)11000rpm离心2分钟至清晰分相。吸取上清液400μL，转入新的做好标记的1.5mL微量离心管中，弃枪头。5)加入800μL在-20℃冰箱预冷的无水乙醇，盖紧盖子，上下颠倒混匀。6)11000rpm离心3分钟至沉淀附于离心管底部，弃上清液。7)70％乙醇洗涤沉淀2遍，将1.5mL微量离心管倒置于平铺于桌上的纸上，自然干燥。8)加入200μL的1/10×TE缓冲液溶解沉淀。9)样品置于-20℃冰箱中保存备用。下面结合具体的实施例对本专利技术技术方案做进一步的说明。实施例12017年5月17日协青早B和东乡野生稻196个BC2F5株系在秧田育苗，6月15日进行移栽至大田，15天后进行取样，将叶片剪碎放入2ml离心管中，加入450μL提取液和直径为5mm小钢珠，在Tissuelyser-192组织研磨仪上25Hz震荡研磨60s。再加入450μL氯仿，上下颠倒混匀，静置5分钟。在11000rpm离心2min至清晰分相。吸取上清液400μL，转入新的做好标记的1.5mL微量离心管中，加入800μL预冷的无水乙醇，盖紧盖子，上下颠倒混匀，11000rpm离心3分钟至沉淀附于离心管底部，弃上清液。加100-200μl灭菌后的ddH2O或1/10TE溶液溶解。PCR实验过程如下：1)将下列试剂从-20℃冰箱中取出解冻：灭菌水、PCR缓冲液(不含氯化镁)、氯化镁溶液、dNTP溶液、正反向引物溶液以及模板DNA。2)所有试剂解冻完毕后，8000rpm离心数秒，放回冰上待用。配制PCR反应液的混合液，10μL反应体系包括灭菌水3.35μL、5×PCR缓冲液2.0μL、25mM氯化镁溶液0.6μL、2.5mMdNTP溶液0.8μL、33ng/μL引物2.0μL和2U/μLTaq聚合酶0.25μL。3)混匀，8000rpm离心数秒。4)将混合液分装至200μLPCR反应板中，再加入1μL模板DNA，盖上硅胶盖。5)盖紧盖子，做好标记。6)将PCR反应板插入PCR扩增仪的200μL孔中，合上热盖，旋紧。打开PCR扩增仪电源开关，选择预设的反应程序如下：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，29个循环，72℃延伸2分钟，10℃低温保存5分钟，开始扩增。7)扩增完成后，退出反应程序，回到主菜单，关闭电源开关。8)打开热盖，取出PCR反应管，置于PCR管架上，放入4℃冰箱中，待用。如图1所示SSR标记RM303检测协青早B(XB)和196个协青早B与东乡野生稻BC2F5株系基因型结果。实施例22017年6月20日赣晚籼30号与长雄野生稻BC3F3群体在秧田育苗，7月19日进行移栽至大田，1个星期后进行取样，将叶片剪碎放入2ml离心管中，加入450μL提取液和直径为5mm小钢珠，在Tissuelyser-192组织研磨仪上25Hz震荡研磨60s。再加入450μL氯仿，上下颠倒混匀，静置5分钟。在11000rpm离心2min至清晰分相。吸取上清液400μL，转入新的做好标记的1.5mL微量离心管中，加入800μL预冷的无水乙醇，盖紧盖子，上下颠倒混匀，11000rpm离心3分钟至沉淀附于离心管底部，弃上清液。加100-200μl灭菌后的ddH2O或1/10TE溶液溶解。PCR实验过程如下：1)将下列试剂从本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水稻DNA的简易提取方法，其特征在于，包括以下步骤：1)从水稻幼苗上剪取叶片并剪成碎片，放入离心管中；2)加入小钢珠和DNA提取液，在Tissuelyser‑192组织研磨仪上震荡研磨；3)加入氯仿颠倒混匀，静置后，离心至清晰分相，吸取上清液转入新的离心管中，弃枪头；4)加入在‑20℃冰箱预冷的无水乙醇，颠倒混匀；5)离心至沉淀附于离心管底部，弃上清液，用乙醇洗涤沉淀，将离心管倒置，自然干燥；6)加入1/10TE缓冲液溶解沉淀，样品置于‑20℃冰箱中保存备用。

【技术特征摘要】
1.一种水稻DNA的简易提取方法，其特征在于，包括以下步骤：1)从水稻幼苗上剪取叶片并剪成碎片，放入离心管中；2)加入小钢珠和DNA提取液，在Tissuelyser-192组织研磨仪上震荡研磨；3)加入氯仿颠倒混匀，静置后，离心至清晰分相，吸取上清液转入新的离心管中，弃枪头；4)加入在-20℃冰箱预冷的无水乙醇，颠倒混匀；5)离心至沉淀附于离心管底部，弃上清液，用乙醇洗涤沉淀，将离心管倒置，自然干燥；6)加入1/10TE缓冲液溶解沉淀，样品置于-20℃冰箱中保存备用。2.根据权利要求1所述的一种水稻DNA的简易提取方法，其特征在于，所述的震荡研磨具体为：在2...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡标林，陈春莲，罗潮洲，彭东华，
申请(专利权)人：江西省农业科学院水稻研究所，
类型：发明
国别省市：江西,36