包裹质粒DNA的阳离子脂质体复合物制造技术

本发明专利技术公开了一种包裹质粒DNA的阳离子脂质体复合物，由阳离子脂质体及其包裹的质粒DNA组成，其中，所述阳离子脂质体由DOTAP与辅助脂质构成，所述质粒DNA为至少一种促进免疫反应的细胞因子的质粒载体；本发明专利技术应用免疫治疗的原理，通过该脂质体的保护，使促免疫细胞因子和抗血管生成蛋白质的重组基因得以在血液里转运，转染肿瘤组织并表达；所述脂质体复合物兼有对肿瘤细胞组织造成缺血性坏死的功能，帮助机体对肿瘤抗原的识别。本发明专利技术的脂质体GM‑csf复合物对早期EMT6乳腺癌细胞肺转移癌治愈率达100%，对终晚期EMT6细胞肺转移癌治愈率达到33%；利用GM‑csf基因与重组VEGFR基因的脂质体复合物联合应用，对终晚期EMT6细胞肺转移癌治愈率提升到50%。

Cationic liposome complexes containing plasmid DNA

The invention discloses a cationic liposome complex encapsulating plasmid DNA, which is composed of a cationic liposome and plasmid DNA encapsulated therein. The cationic liposome is composed of DOTAP and auxiliary lipids. The plasmid DNA is a plasmid carrier for at least one cytokine promoting immune response; the invention applies immunotherapy. The liposome complex has the function of causing ischemic necrosis of tumor cells and helping the body to recognize tumor antigen. The liposome GM_csf complex of the invention has a cure rate of 100% for lung metastasis cancer of early EMT6 breast cancer cells and 33% for lung metastasis cancer of late EMT6 cells, and a cure rate of 50% for lung metastasis cancer of late EMT6 cells by combining GM_csf gene with liposome complex of recombinant VEGFR gene.

【技术实现步骤摘要】
包裹质粒DNA的阳离子脂质体复合物
本专利技术涉及肿瘤的基因治疗
，尤其涉及一种包裹质粒DNA的阳离子脂质体复合物及其制备方法。
技术介绍
细胞分裂是机体发育和组织修复的正常过程。母细胞分裂成两个相等的子细胞，这些子细胞可能进一步分化，装配新的组织，或者取代老化的细胞或受到伤害的组织。当机体不再需要更多的细胞时，健康细胞通过接触抑制、细胞因子、生长激素调控等手段，不再分裂。当健康细胞产生一系列基因突变，细胞分裂不再受到机体的调控，从而形成肿瘤细胞。肿瘤细胞是不断分裂的细胞，生成瘤块，并能通过血液向远端的组织进行转移。一般人们所说的“癌症”习惯上泛指所有恶性肿瘤。恶性肿瘤具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征，其发生是一个不断产生基因突变、受多因子影响的复杂过程。根据中国国家肿瘤防治中心的统计，癌症(恶性肿瘤)也是目前中国疾病导致死亡的头号杀手。其中，又以肺癌的发病率最高。每年在中国有60万患者死于肺癌，是十大癌症死亡原因之首，且有逐年增加的趋势。根据2010年美国癌症协会的报告，癌症是美国仅次于心脏病致死的主要原因。约31％的男性和26％的女性死于肺癌或支气管癌。癌症治疗的常规手段包括手术，化疗，放疗。理论上，以手术完全移除肿瘤细胞，癌症是可以被治愈的。对早期或较早期实体肿瘤来说，手术切除仍然是首选的治疗方法。化疗和放疗均显示出较大的副作用。在过去以传统放化疗和手术治疗为主要治疗手段的几十年中，在改善长期结果和总体生存率方面取得的进展相对较小，特别是病人诊断出肿瘤时往往已是中晚期，患者5年生存率很低。概念上迫切需要新方法，即有针对性的药物。2010年美国药物和食品管理局(FDA)批准的第一个细胞免疫的肿瘤治疗技术(Provenge)，拉开了肿瘤免疫治疗的大幕。2014年至2017年有5个针对PD-1/PD-L1免疫检测靶点的抗体药物获批上市。以CAR-T为代表的细胞免疫疗法目前也已经有两款上市，即诺华的Kymriah以及Kite公司的Yescarta。这些药物或治疗技术在肿瘤治疗的长效性和延长患者生存率方面表现优异，并且副作用降低，PD-1/PD-L1抗体成为目前最好的抗癌药，标志着在细胞、分子和机体各个层面的免疫治疗正式成为肿瘤治疗的主角，癌症治疗已进入免疫治疗时代。肿瘤免疫治疗未来的发展方向不仅是从根本上替代化疗和放疗，甚至可能会替代一部分手术，拥有广阔的前景。现代肿瘤免疫治疗最重要发现是细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTLymphocyte，CTL)能够抑制肿瘤生长，而且是杀死肿瘤细胞的主要力量。无论是基于细胞、免疫抑制检查点、增强免疫细胞因子和溶瘤病毒免疫治疗的方案，都是围绕CTL的扩增和调控设计的，主要依仗携带CD8+、CD4+等表面抗原的T淋巴细胞对肿瘤细胞的识别和清除。T淋巴细胞表面抗体识别多肽抗原，包括肿瘤抗原(Neoantigen)。肿瘤抗原是专一地反映肿瘤细胞中基因突变产生的变异多肽，因此针对肿瘤抗原产生的T淋巴细胞具有非常高的肿瘤专一性，毒副作用小。癌症免疫周期包括几个连续的步骤：癌细胞产生的肿瘤抗原被树突细胞捕获。树突细胞将主要组织相容性复合物(MHC)分子中的捕获的抗原呈递给T淋巴细胞，引发和激活针对特异肿瘤抗原的CTL应答。在趋化因子梯度引导下，活化的CTL流入并浸润肿瘤组织。通过T细胞受体(TCR)和新抗原MHC复合物之间的相互作用，CTL利用表面抗体特异识别、结合并杀死具有可识别抗原的肿瘤细胞。少数肿瘤患者发生自愈的现象，证实人体自身的免疫系统可以识别并杀伤肿瘤细胞，浸润肿瘤的免疫细胞(TIL)是病理上的直接证据。起作用的一类免疫细胞是效应细胞，直接对肿瘤产生杀伤或抑制。很多细胞都加入这个过程，如NK细胞、巨噬细胞、粒细胞、嗜酸性白细胞等，但是作用最大的还是CTL，特别是CD8+T淋巴细胞。还有一类是调节细胞，它不直接损伤肿瘤，而是调节控制效应细胞的功能。免疫系统识别两类抗原：抗体识别的抗原和T细胞识别的抗原。过去的研究发现了许多抗体识别的肿瘤抗原，如CD19，CA-125等，大都不是肿瘤特异的。例如，CD19是正常B细胞抗原，但在B细胞衍生的肿瘤细胞中高表达，使其成为CAR-T疗法治疗急性淋巴母细胞白血病的靶点之一，B细胞急性淋巴细胞白血病患者的响应率达到惊人的82.5％[1]。2017年8月，Tisagenlecleucel(CD19-CAR-T，Kymriah)获批上市，成为第一个FDA批准的细胞免疫治疗方法。改造后的T淋巴细胞表达嵌合受体，靶向结合B细胞表面的CD19蛋白质，因此，CD19-CAR-T治疗是以牺牲正常B细胞为代价，有很大的副作用和治疗风险。T细胞识别的抗原为多肽，可以是高表达的正常胚胎蛋白、分化相关因子和因突变获得的肿瘤异常蛋白。前二者在肿瘤细胞中特征性高表达或在机体早期发育过程中曾出现过的抗原。肿瘤发生过程因体细胞基因突变而产生，伴随有肿瘤变异蛋白的生成。常与肿瘤发生有关的基因包括POLE、p53、Ras、EGFR等，突变产生变异多肽抗原，可以被T细胞识别。这些突变具有很强的肿瘤专一性，成为免疫治疗中靶向识别的目标。如使用RNA测序数据所鉴定的，癌症病变中CD8+T细胞数量在具有高突变率的肿瘤中较高[2]。肿瘤免疫治疗的基本设计思路归纳起来有两个途径：一个是增强免疫反应，另一个是对肿瘤免疫逃逸机制的纠正。增强免疫反应代表了大部分现有免疫治疗的方法，比如IL-2，抗CD19肿瘤疫苗，CAR-T治疗，抗CTLA-4，增强DC细胞对肿瘤抗原的提呈，表达粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-csf)的溶瘤病毒等。但增强免疫反应的治疗方法，一般是通过血液进行全身性给药，可能产生针对正常细胞和组织的免疫杀伤，很多时候是弊大于利，只在很少癌症类型中有好处。对肿瘤免疫逃逸机制的纠正，比如对PD-1/PD-L1免疫检查点的纠正，激活CTL对肿瘤细胞的特异攻击，肿瘤治疗免疫反应是高度特异的，不损伤或很少损伤自身组织。这种纠正方法依赖于机体本身已经发生的、针对肿瘤的免疫反应，因此患者响应率一般较低。PD-1/PD-L1抗体治疗对很多种肿瘤有效，但是它只对每种癌症的一小部分病人有效果，例如仅对大约30％的肺癌有疗效。如果病人的肿瘤组织为PD-L1阳性，有效率进一步提高到50％左右。对何杰金淋巴瘤有效率接近90％，黑色素瘤有效率达40-50％，膀胱癌50％，消化道肿瘤如胃癌，食管癌和肝癌的有效率也在30％以下。治疗有响应的病人，抗PD-1治疗可以明显提高存活时间，但并不是对所有晚期肿瘤病人都有效，并且随着抗PD-1治疗的开展，也有了肿瘤复发的报道。“下一个最有效免疫检查点靶点是什么？”，是肿瘤免疫治疗领域问得最多的一个问题，也正是限制这种治疗方法的主要问题之一。抗免疫抑制检查点疗法，依赖于机体已有肿瘤抗原特异的CTLs对肿瘤细胞的识别，对异质性肿瘤治疗需要多克隆的肿瘤特异CTLs。因此针对免疫抑制检查点实施的抗肿瘤治疗方法，前体是机体已经产生识别肿瘤抗原的特殊CTLs。肿瘤免疫逃逸机制机体的免疫系统能产生抗肿瘤免疫应答，对极少数幸运患者的肿瘤有治愈的功效，但是对绝大多数肿瘤患者而言，肿瘤仍能在机体内进行生长，转移，如果没有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包裹质粒DNA的阳离子脂质体复合物，其特征在于：由阳离子脂质体及其包裹的质粒DNA组成，其中，所述阳离子脂质体由DOTAP与辅助脂质构成，所述质粒DNA为至少一种促进免疫反应的细胞因子的质粒载体。

【技术特征摘要】
1.一种包裹质粒DNA的阳离子脂质体复合物，其特征在于：由阳离子脂质体及其包裹的质粒DNA组成，其中，所述阳离子脂质体由DOTAP与辅助脂质构成，所述质粒DNA为至少一种促进免疫反应的细胞因子的质粒载体。2.根据权利要求1所述的包裹质粒DNA的阳离子脂质体复合物，其特征在于：所述复合物中DNA质粒的平均粒径小于240nm。3.根据权利要求1所述的包裹质粒DNA的阳离子脂质体复合物，其特征在于：所述阳离子脂质体是由DOTAP与卵磷脂构成，其摩尔比为20:(8-11)。4.根据权利要求1所述的包裹质粒DNA的阳离子脂质体复合物，其特征在于：所述阳离子脂质体是由DOTAP与胆固醇构成，其摩尔比为20:18。5.根据权利要求1所述的包裹质粒DNA的阳离子脂质体复合物，其特征在于：所述质粒DNA为GM-csf、G-csf、IFN-γ、白介素、TNFα、细胞因子、抗血管生成因子或...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐凯，罗徳伦，唐放，吴秀景，张耀艺，
申请(专利权)人：成都诺恩基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51