一种在淋巴细胞中高水平的和稳定的基因转移的方法技术

本发明专利技术公开的方法描述了一种能够以空前的效率、灵活性、实用性和速度将转基因稳定整合到淋巴细胞和其他哺乳动物细胞中的新技术。该新方法是基于使用mRNA编码的转座酶[例如睡美人(Sleeping Beauty)转座酶]与微环DNA编码的转座因子的组合。该新方法能够实现更高的基因转移速率，同时比常规方法毒性低，所述常规方法即使用质粒DNA编码的转座酶与质粒DNA编码的转座因子的组合。本发明专利技术的应用包括但不限于将编码免疫受体(例如T细胞受体或合成嵌合抗原受体)的转基因稳定整合到人T淋巴细胞中，其中免疫受体对肿瘤细胞表达的分子具有特异性。转座酶mRNA和转座子微环DNA可通过包括但不限于如电穿孔和核转染的电转移方法导入淋巴细胞中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种在淋巴细胞中高水平的和稳定的基因转移的方法
本专利技术涉及基因转移的方法和技术以及免疫治疗的方法和技术。
技术介绍
越来越多的基因修饰的细胞和组织被应用于生物体的诊断和治疗当中。例如通过引入一个或几个转基因赋予细胞新的特性，或通过引入一个或几个基因修饰子来调节或除去不同的特性和功能来进行基因修饰。基因修饰的细胞应用在治疗中的一个令人印象深刻的例子是工程化T细胞的应用，通过基因转移对该工程化T细胞进行修饰使其表达能够识别肿瘤细胞表达的分子的T细胞受体(TCR)或合成的嵌合抗原受体(CAR)，并因此赋予该工程化T细胞的抗肿瘤特异性。临床前的肿瘤模型以及晚期化疗和放疗的难治性恶性肿瘤患者的临床试验中有令人信服的证据表明，这些工程化TCR-和CAR-修饰的T细胞具有抗肿瘤能力和治疗潜力(HudecekBlood2010；HudecekCancerImmunolRes2013；HudecekCancerImmunolRes2015；HudecekLeukemia2015；KalosScienceTranslMed2011；GruppNEnglJMed2013；DavilaScienceTranslMed2014；MaudeNEnglJMed2014)。实现基因转移到T细胞中的最常用策略是使用病毒递送系统，如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒载体。病毒递送系统已被用于将包括TCR和CAR的转基因稳定整合到人T淋巴细胞中，从而能够制造在临床前和临床时使用的肿瘤反应性TCR-/CAR-T淋巴细胞。尤其例如，已经证实整装了对CD19具有特异性的合成嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞在中试研究中对B细胞恶性肿瘤具有显著的疗效(参考文献1-3)。在迄今为止报道的所有CD19-CART细胞疗法具有功效的临床试验中，都是使用整合的慢病毒(LV)或γ-逆转录病毒(RV)载体来实现CAR基因的转移和表达。然而，与病毒的基因转移载体相关的应用有许多概念性的、技术上的和策略上的缺陷，包括随时间推移的转基因沉默、优先整合到基因组的转录活性位点中时伴随着其他基因的非期望激活(例如癌基因)和遗传毒性的非期望潜能；以及制造、储存和处理整合病毒的费用和繁琐的努力——其中后者妨碍了它们在治疗应用中更广泛地应用于制造基因修饰的T细胞。因此，病毒载体在安全性方面以及在全球范围内建立CART细胞治疗所需的载体生产的成本和规模一直受到持续关注。转座子技术是实现稳定基因转移的另一种策略。转座子或转座因子(TE)是能够稳定整合到宿主细胞基因组中的遗传元件，这个整合到宿主细胞基因组中的过程称为转座(IvicsMobileDNA2010)。早在20世纪50年代，BarbaraMcClintock在玉米的遗传学研究中就推测到了TE的存在，但直到20世纪70年代末才描述了用于细菌TE的第一个转座功能模型(ShapiroPNAS1979)。同时显而易见地是，TE存在于每个生物体的基因组中，并且基因组测序显示约45％的人类基因组是来源于转座子(InternationalHumanGenomeSequencingConsortiumNature2001)。然而，与已经确定功能性(或自主性)TE的无脊椎动物相反，人类和大多数高等脊椎动物不包含功能性TE。据推测，进化过程中的选择压力抵抗TE的致突变潜力，导致其在数百万年前的进化过程中发生功能性失活。自主TE包含编码位于两个反向末端重复序列(ITR)之间的转座酶的DNA，所述两个反向末端重复序列(ITR)由ITR之间编码的转座酶识别并且其能够催化TE转座到任何双链DNA序列中。转座子有两种不同的类型：通过RNA中间体和“复制-和-粘贴”机制调动的I类或反转录转座子，以及通过切除-整合或“剪切-和-粘贴”机制调动的II类或DNA转座子(IvicsNatMethods2009)。似乎大多细菌、低等真核生物(例如酵母)和无脊椎动物的转座子是物种特异性的，并且不能用于脊椎动物细胞中DNA的有效转座。直到通过序列改组来源于鱼类的非活性的TE[这些转座子因此被称为“睡美人(SleepingBeauty)”(IvicsCell1997)]后，才人工重建出第一个有活性的转座子，并将转座子导入包括人类细胞在内的脊椎动物细胞，成功地实现了DNA整合。睡美人是属于Tcl/marine转座子家族的II类DNA转座子(NiGenomicsProteomics2008)。与此同时，从包括果蝇、青蛙甚至人类的不同物种的基因组中鉴定或重建了额外的功能转座子，所有这些功能转座子都被证明可以将DNA转座到脊椎动物以及人类宿主细胞的基因组中。这些转座子每一个都具有与转座效率、表达稳定性、基因有效载荷能力等相关的优点和缺点。专利技术简述本专利技术公开的方法描述了一种能够以有着空前的效率、灵活性、实用性和速度的新技术，其能将转基因稳定整合到淋巴细胞和其他哺乳动物细胞中的新技术。该新方法是基于使用mRNA编码的转座酶[例如睡美人(SleepingBeauty)转座酶]与微环DNA编码的转座因子的组合。该新方法能够实现更高的基因转移率，同时比常规方法毒性低，所述常规方法即使用质粒DNA编码的转座酶与质粒DNA编码的转座因子的组合。以下效果将有助于通过根据本专利技术的微环实现更高的基因转移率：·与质粒相比，微环的半衰期更长，·与质粒相比，微环更容易从细胞质迁移到细胞核中，·与大型环状质粒相比，小型超螺旋MC更易于转座子的调动。根据本专利技术所述内容，这些效果不限于微环，而且也适用于编码包含转基因表达盒的转座因子的任何其他DNA，条件是这种DNA具有比适合作为转座因子的供体质粒的常规质粒更小的尺寸。因此，根据本专利技术所述内容，也可以使用编码包含转基因表达盒的转座因子的任何DNA，只要编码转座因子的DNA是编码如下定义的转座因子的DNA。由于根据本专利技术实现了更高的基因转移率，将有助于在良好生产规范(GMP)下实施本专利技术的方法和用途。例如，当本专利技术用于产生CART细胞时，CD3/CD28刺激可用于在转染前活化T细胞，并且和现有技术方法不同，本专利技术不需要使用饲养细胞来扩增CART细胞，以获得达到治疗相关剂量的CART细胞。根据本专利技术所述内容，低剂量的转染的微环DNA(与质粒DNA相比)有助于减少由微环带来的毒性。此外，这种效果不限于微环，而且也适用于编码包含转基因表达盒的转座因子的任何其他DNA，条件是这种DNA具有比适合作为转座因子供体质粒的常规质粒更小的尺寸。因此，根据本专利技术所述内容，也可以使用编码包含转基因表达盒的转座因子的任何DNA，只要编码转座因子的DNA是编码如下定义的转座因子的DNA。本专利技术的另一个优点是由于在微环中缺乏抗生素抗性基因，排除了抗生素抗性基因向宿主细菌的水平基因转移和抗生素抗性基因非目的性地整合到宿主基因组中的情况。根据本专利技术所述内容，发现mRNA可以作为一种转座酶的来源。这一发现是出乎意料的，因为mRNA的寿命短，并不知道其是否是一种为本专利技术提供足够量的转座酶的合适的来源。根据本专利技术所述内容，使用mRNA作为转座酶的来源具有两个优点：首先，因为由mRNA提供的转座酶寿命短，已经整合的转座子重新移动的风险较低。其次，mRNA作为转座酶的供应，消除了转座酶表达盒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种应用，所述应用为使用一种编码转座因子的微环DNA以及一种转座酶的来源的组合，以稳定地将转座因子整合到哺乳动物细胞的基因组中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.22 EP 15002732.4;2016.01.29 EP 16153490.41.一种应用，所述应用为使用一种编码转座因子的微环DNA以及一种转座酶的来源的组合，以稳定地将转座因子整合到哺乳动物细胞的基因组中。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转座酶的来源是编码所述转座酶的核酸。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，编码所述转座酶的核酸是编码所述转座酶的mRNA、编码所述转座酶的质粒DNA、编码所述转座酶的微环DNA或编码所述转座酶的线性DNA。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，编码所述转座酶的核酸是编码所述转座酶的mRNA。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，编码所述转座酶的核酸是编码所述转座酶的微环DNA。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，编码所述转座酶的微环DNA和编码所述转座因子的微环DNA是相同的微环DNA。7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转座酶的来源是转座酶多肽。8.如前述权利要求任一项所述的应用，其特征在于，所述转座酶是SB100X。9.如前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物细胞是哺乳动物淋巴细胞。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物淋巴细胞是人淋巴细胞。11.如权利要求9或10所述的应用，其特征在于，所述淋巴细胞是T淋巴细胞。12.如权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物细胞是CD8+杀伤T细胞、CD4+辅助T细胞、初始T细胞、记忆T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞、恒定T细胞、NKT细胞、细胞因子诱导的杀伤T细胞、g/dT细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或粒细胞。13.如前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物细胞是CD8+杀伤T细胞或CD4+辅助T细胞。14.如前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于，所述转座因子包含用于表达T细胞受体或嵌合抗原受体的遗传信息，并且所述哺乳动物细胞是人T淋巴细胞。15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述T细胞受体或嵌合抗原受体是肿瘤反应性的，并且通过所述应用获得的所述人T淋巴细胞是适用于癌症的过继免疫治疗的肿瘤反应性人T淋巴细胞。16.如权利要求14或15所述的应用，其特征在于，所述转座因子包含嵌合抗原受体的遗传信息。17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述嵌合抗原受体对CD19、CD20、CD22、CD33、CD44v6、CD123、CD135、EpCAM、EGFR、EGFR变体、GD2、ROR1、ROR2、CD269、CD319、CD38或CD138具有特异性。18.如前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于，编码所述转座因子的微环DNA编码a/b或g/dT细胞受体、细胞因子、自杀基因或转导标记。19.如前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用是在体外应用。20.如权利要求2～6或8～19任一项所述的应用，其特征在于，编码所述转座酶的核酸和编码所述转座因子的DNA微环通过电转如电穿孔或核转染、化学转染如磷酸钙、或纳米颗粒导入细胞。21.如权利要求2～7或9～20任一项所述的应用，其特征在于，介导转座因子转座到基因组的所述转座酶是SleepingBeauty、PiggyBac、FrogPrince、Himarl、Passport、Minos、hAT、Tol1、Tol2、AciDs、PIF、Harbinger、Harbinger3-DR和Hsmar1，或其具有转座活性的衍生物。22.一种应用，所述应用为使用一种编码包含转基因表达盒的转座因子的DNA以及一种转座酶的来源的组合，以将转座因子稳定地整合到哺乳动物细胞的基因组中；其中，所述编码转座因子的DNA缺乏复制起点和/或缺乏抗生素抗性基因。23.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述编码转座因子的DNA缺乏复制起点。24.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述编码转座因子的DNA缺乏抗生素抗性基因。25.如权利要求22～24任一项所述的应用，其特征在于，所述编码转座因子的DNA缺乏复制起点和缺乏抗生素抗性基因。26.如权利要求22～25任一项所述的应用，其特征在于，所述编码转座因子的DNA可以通过从质粒中删除所述复制起点和/或所述抗生素抗性基因获得，所述质粒选自由以下组成的组：pT；pT2；具有与pT的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；具有与pT2的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；和任何适合作为转座因子供体质粒的其他质粒。27.一种应用，所述应用为使用一种编码包含转基因表达盒的转座因子的DNA和一种转座酶的来源的组合，以将转座因子稳定地整合到哺乳动物细胞的基因组中；其中，所述编码转座因子的DNA可以通过缩短质粒的至少一个碱基对而获得，并且其中所述质粒选自由以下组成的组：pT；pT2；具有与pT的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；具有与pT2的DNA序列至少90％同源的DNA序列的质粒；和任何适合作为转座因子供体质粒的其他质粒。28.如权利要求22～27任一项所述的应用，其特征在于，所述编码转座因子的DNA的总长度比所述表达盒的长度长不超过3.0kb，优选不超过2.0kb。29.如权利要求22～28任一项所述的应用，其特征在于，所述编码转座因子的DNA的总长度比所述表达盒的长度长不超过1.5kb。30.如权利要求22～29任一项所述的应用，其特征在于，所述编码转座因子的所述DNA的总长度比所述表达盒的长度长不超过1.0kb。31.如权利要求22～30任一项所述的应用，其特征在于，所述编码转座因子的DNA是权利要求1～21任一项所用的微环DNA。32.如权利要求22～31任一项所述的应用，其特征在于，所述转基因是如权利要求14～17任一项所定义的T细胞受体或嵌合抗原受体，且所述哺乳动物细胞是人T淋巴细胞。33.如权利要求22～31任一项所述的应用，其特征在于，所述转基因是a/b或g/dT细胞受体、细胞因子、自杀基因或转导标记。34.如权利要求22～33任一项所述的应用，其特征在于，所述应用是在体外应用。35.如权利要求22～34任一项所述的应用，其特征在于，所述转座酶的来源为如权利要求2～6、8或21中任一项所定义的转座酶的来源。36.如权利要求22～31和33～35中任一项所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物细胞为如权利要求9～14中任一项所定义的哺乳动物细胞。37.如前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物细胞是原代细胞，优选原代人细胞。38.如前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用是非病毒的应用。39.一种获得包含稳定整合的转座因子的重组哺乳动物细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：将编码转座因子的微环DNA与编码转座酶的核酸的组合导入哺乳动物细胞中，从而获得所述重组哺乳动物细胞。40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述编码转座酶的核酸为如权利要求3～6、8或21中任一项所定义的编码转座酶的核酸。41.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述转座酶是SB100X。42.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是哺乳动物淋巴细胞。43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物淋巴细胞是人淋巴细胞。44.如权利要求42或43所述的方法，其特征在于，所述淋巴细胞是T淋巴细胞。45.如权利要求39～41任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是CD8+杀伤T细胞、CD4+辅助T细胞、初始T细胞、记忆T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞、恒定T细胞、NKT细胞、细胞因子诱导的杀伤T细胞、g/dT细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或粒细胞。46.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是CD8+杀伤T细胞或CD4+辅助T细胞。47.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述转座因子包含用于表达T细胞受体或嵌合抗原受体的遗传信息，和所述哺乳动物细胞是人T淋巴细胞。48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述T细胞受体或嵌合抗原受体是肿瘤反应性的，并且通过所述方法获得的所述人T淋巴细胞是适用于癌症的过继免疫治疗的肿瘤反应性人T淋巴细胞。49.如权利要求47或48所述的方法，其特征在于，所述转座因子包含嵌合抗原受体的遗传信息。50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述嵌合抗原受体对CD19、CD20、CD22、CD33、CD44v6、CD123、CD135、EpCAM、EGFR、EGFR变体、GD2、ROR1、ROR2、CD269、CD319、CD38或CD138具有特异性。51.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，编码所述转座因子的微环DNA编码a/b或g/dT细胞受体、细胞因子、自杀基因或转导标记。52.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法是体外方法。53.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，编码所述转座酶的核酸和编码所述转座因子的DNA微环通过电转如电穿孔或核转染、化学转染如磷酸钙、或纳米颗粒导入细胞。54.如权利要求39～41或43～53任一项所述的方法，其特征在于，介导转座因子转入基因组的所述转座酶是SleepingBeauty、PiggyBac、FrogPrince、Himarl、Passport、Minos、hAT、Tol1、Tol2、AciDs、PIF、Harbinger、Harbinger3-DR和Hsmar1，或其具有转座活性的衍生物。55.如前述权利要求中任一项所述的方法或应用，其特征在于，编码转座因子的微环DNA与编码转座酶的核酸的所述组合是一起被导入哺乳动物细胞当中。56.如权利要求54所述的方法或应用，其特征在于，所述编码转座因子的微环DNA和编码转座酶的核酸是相同的微环DNA。57.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述编码转座酶的核酸和编所述码转座因子的微环DNA以1：1或更大的摩尔比导入哺乳动物细胞中；较佳地，所述摩尔比为2:1～10:1；更佳地，所述摩尔比为3:1～9:1；进一步更佳地，所述摩尔比为4:1至8:1。58.一种获得包含稳定整合的转座因子的重组哺乳动物细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：将编码含有转基因表达盒的转座因子的DNA和编码转座酶的核酸的组合导入哺乳动物细胞中，从而获得所述重组哺乳动物细胞；其中，所述编码转座因子的DNA缺乏复制起点和/或缺乏抗生素抗性基因。59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述编码转座因子的DNA缺乏复...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·胡德塞克，佐尔坦·伊维奇，
申请(专利权)人：尤利乌斯·马克西米利安维尔茨堡大学，
类型：发明
国别省市：德国,DE