一种可光控基因转染的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层及其制备方法和调控方法技术

本发明专利技术公开了一种可光控基因转染的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层及其制备方法和调控方法。该复合涂层是先在基底材料上生长二氧化钛纳米棒阵列,在固定基因/载体复合物后，将纳米金/胶原混合溶液旋涂在二氧化钛纳米棒阵列上，且使二氧化钛纳米棒阵列端部暴露在纳米金/胶原层之上。本发明专利技术所得到的复合涂层具有良好的生物相容性，且更有利于细胞的铺展。纳米金的光热效应可控制胶原的降解，进而控制基因的释放，此外，二氧化钛纳米棒端部露出纳米金/胶原层的结构设计，可以为细胞生长提供良好的三维微环境，并且还可有效避免胶原光热降解后细胞脱落；本方法可广泛用于基因治疗和基因功能研究领域。

A Phototransfectable Titanium Dioxide/Nano-Au/Collagen Composite Coating and Its Preparation and Control Method

The invention discloses a titanium dioxide/nano-gold/collagen composite coating capable of light-controlled gene transfection, a preparation method and a control method thereof. The composite coating firstly grows the titanium dioxide nanorod array on the substrate material. After fixing the gene/carrier composite, the gold/collagen mixture solution is spin-coated on the titanium dioxide nanorod array, and the end of the titanium dioxide nanorod array is exposed to the gold/collagen layer. The composite coating prepared by the invention has good biocompatibility and is more conducive to cell spreading. The photothermal effect of gold nanoparticles can control the degradation of collagen and the release of genes. In addition, the structure of gold nanoparticles / collagen layer exposed at the end of titanium dioxide nanorods can provide a good three-dimensional micro-environment for cell growth, and can effectively avoid collagen photothermal degradation after cell shedding. The field of gene therapy and gene function research.

【技术实现步骤摘要】
一种可光控基因转染的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层及其制备方法和调控方法
本专利技术属于生物医用领域，具体涉及一种可光控基因转染的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层及其制备方法和调控方法。
技术介绍
作为一种新型的治疗手段，基因治疗由于在遗传病和肿瘤治疗方面有极大的应用前景，近些年在生物医学领域得到广泛应用。基因治疗即将外源正常基因导入目标细胞，从而表达特定的蛋白，达到治疗疾病的目的。基因治疗中关键问题是如何有效地将外源正常基因导入目标细胞。基因转染技术的发展为基因治疗提供了有力的保障，因此，如何实现安全、高效的基因转染技术成为基因治疗中的重要问题。传统的基因转染技术是培养细胞，然后向细胞培养液中加入基因/载体复合物。这种转染方式基因/载体复合物利用率低，所需量大，细胞毒性大；转染过程可控性差。在传统基因转染技术中，通常通过设计基因载体来增加转染效率，但在安全性和可控性方面仍然存在很大的问题。表面介导基因转染技术是以材料表面作为基因/载体复合物的承载平台，先将复合物固定在材料表面上，然后接种细胞，细胞通过胞吞作用摄取材料表面的复合物，进而表达特定的蛋白，完成转染。与传统转染技术相比，表面介导基因转染技术具有很多优势：可以实现基因在细胞周围的局部浓缩，提高了基因的利用率，减少细胞毒性；增加了与细胞的接触几率，增大转染效率；基因在材料表面处于锚定状态，可实现原位转染；为可控的转染过程提供了可能性。目前，表面介导基因转染技术中基因/载体复合物的释放方式多侧重于长时间持续地释放，但在某些疾病的基因治疗过程中，需要实现复合物在特定时间下的快速释放，建立一种特定时间下实现复合物快速释放的转染体系是一项技术难题。BurcuS等通过外加电场使聚阳离子层和DNA层发生分离，使DNA释放[B.S.Aytaretal.RapidReleaseofPlasmidDNAfromSurfacesCoatedwithPolyelectrolyteMultilayersPromotedbytheApplicationofElectrochemicalPotentials,AcsAppliedMaterials&Interfaces,4(2012)2726-2734.]。光场具有生物安全性高，易于操作，可非接触性控制等优点，构建一种可光场控制基因/载体复合物释放和促进细胞摄入的基因转染体系对于基因治疗的临床应用和基因功能研究具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种生物相容性良好、制备方法简便、可光场调控基因转染的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层及其制备方法和调控方法。本专利技术的一种可光控基因转染的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层，采用如下方法制得：先在基底材料上制备二氧化钛纳米棒阵列，固定基因/载体复合物后利用旋涂的方法将纳米金/胶原混合溶液旋涂在二氧化钛纳米棒阵列上，纳米金/胶原层嵌于二氧化钛纳米棒阵列之间，并且二氧化钛纳米棒阵列端部暴露在纳米金/胶原层之上。上述技术方案中，优选的，所述的二氧化钛纳米棒的密度为5×108～8×109/cm2，棒的直径范围为20～100nm，棒的长度为350～800nm。优选的，所述的基因/载体复合物采用浸泡法或滴液法固定在二氧化钛纳米棒阵列上。优选的，所述的基底材料为石英玻璃、导电玻璃、钽片、硅片。优选的，所述的纳米金为金纳米颗粒、金纳米棒；金纳米颗粒尺寸为10～100nm，金纳米棒的长径比为2.5～4.5。优选的，所述的纳米金/胶原混合溶液中纳米金的浓度为200～1000μg/ml。优选的，所述的胶原为Ⅰ型胶原，纳米金/胶原混合溶液中胶原浓度为1～3mg/ml。具体的制备方法包括以下步骤：1)在基底材料表面制备二氧化钛纳米点晶种层；2)将质量浓度37.5％的盐酸加入到去离子水中，盐酸和去离子水的的体积比为49:50，然后向溶液中加入钛酸四丁酯，使钛酸四丁酯浓度为300～500mM，得到母液；将步骤1)的长有二氧化钛纳米点晶种层的基板置于水热釜中，然后加入母液，在160～200℃生长2～4h，获得生长有二氧化钛纳米棒阵列的基板；3)将基因/载体复合物溶液以1μg/cm2的DNA密度滴加在步骤2)中制备的二氧化钛纳米棒阵列上或将步骤2)中制备的二氧化钛纳米棒阵列薄膜浸泡在10μg/ml的DNA溶液中；4)用冰醋酸溶液溶解Ⅰ型胶原，随后加入纳米金，配置成胶原浓度为1～3mg/ml，纳米金浓度为200～1000μg/ml的纳米金/胶原混合溶液；然后将混合溶液滴于步骤3)处理后的基板上，旋涂获得纳米金/胶原层，并使二氧化钛纳米棒阵列端部暴露在纳米金/胶原层之上，得到可光控释放基因的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层。上述的可光控释放基因的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层的基因释放方法可采用：将波长为400～700nm的可见光从样品上方入射，光强为0.5～3.5W/cm2，照射时间为5～20分钟。也可以采用：将波长为808nm的激光从样品上方入射，光强为0.5～4W/cm2，照射时间为0.5～5分钟。本专利技术中所述的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层具有良好的生物相容性，通过控制纳米金/胶原复合涂层的旋涂厚度使二氧化钛纳米棒端部露出，露出的二氧化钛纳米棒端部阵列为细胞生长提供了三维微环境利于细胞生长，并且还可有效避免胶原光热降解后细胞脱落；胶原有利于细胞的粘附、铺展及增殖。所使用的光场操作简便、可控性强、生物安全性高。本专利技术中的复合涂层具有良好的光控释放基因/载体复合物的性能，便于推广应用，可广泛应用于基因治疗和基因功能研究领域。附图说明图1(a)是二氧化钛/金纳米颗粒/胶原复合涂层的SEM图，(b)二氧化钛/金纳米颗粒/胶原复合涂层断面的SEM图。图2是二氧化钛/金纳米颗粒/胶原复合涂层和二氧化钛纳米棒阵列培养细胞1天、3天的吸光度值。图3是细胞在二氧化钛/金纳米颗粒/胶原复合涂层和二氧化钛纳米棒阵列上培养1天的光学显微镜图。图4是有无光照时胶原降解情况的SEM图。具体实施方式下面结合实施例和附图来详细说明本专利技术，但本专利技术并不仅限于此。实施例11)将钛酸四丁酯、乙酰丙酮和去离子水以摩尔比1:0.3:1的比例加入到无水乙醇中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮在室温下充分搅拌，配置成钛原子浓度为0.3M，聚乙烯吡咯烷酮浓度为40mg/ml的二氧化钛纳米点前驱体溶胶。然后将溶胶滴于石英玻璃表面，以8000rpm的速度旋涂40s，随后置于700℃下保温1h，得到二氧化钛纳米点晶种层。2)将质量浓度37.5％的盐酸加入到去离子水中，盐酸和去离子水的的体积比为49:50，然后向溶液中加入钛酸四丁酯。使钛酸四丁酯浓度为300mM，得到母液。将步骤1)的二氧化钛纳米点基板置于水热釜中，然后加入母液，在160℃生长2h，获得生长有二氧化钛纳米棒阵列的基板。3)将基因/载体复合物溶液以1μg/cm2的DNA密度滴加在步骤2)中制备的二氧化钛纳米棒阵列上，4℃保存至样品干燥完全。4)用0.2M的冰醋酸溶液溶解Ⅰ型胶原，随后加入直径为20nm的金纳米颗粒，配置成胶原浓度为2mg/ml，金纳米颗粒浓度为500μg/ml的金纳米颗粒/胶原混合溶液。然后将混合溶液滴于步骤3)中制备的薄膜中，以6000rpm的速度旋涂40s，得到二氧化钛/金纳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可光控基因转染的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层，其特征在于，采用如下方法制得：先在基底材料上制备二氧化钛纳米棒阵列，固定基因/载体复合物后利用旋涂的方法将纳米金/胶原混合溶液旋涂在二氧化钛纳米棒阵列上，纳米金/胶原层嵌于二氧化钛纳米棒阵列之间，并且二氧化钛纳米棒阵列端部暴露在纳米金/胶原层之上。

【技术特征摘要】
1.一种可光控基因转染的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层，其特征在于，采用如下方法制得：先在基底材料上制备二氧化钛纳米棒阵列，固定基因/载体复合物后利用旋涂的方法将纳米金/胶原混合溶液旋涂在二氧化钛纳米棒阵列上，纳米金/胶原层嵌于二氧化钛纳米棒阵列之间，并且二氧化钛纳米棒阵列端部暴露在纳米金/胶原层之上。2.如权利要求1所述的可光控基因转染的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层，其特征在于，所述的二氧化钛纳米棒的密度为5×108～8×109/cm2，棒的直径范围为20～100nm，棒的长度为350～800nm。3.如权利要求1所述的可光控基因转染的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层，其特征在于，所述的基因/载体复合物采用浸泡法或滴液法固定在二氧化钛纳米棒阵列上。4.如权利要求1所述的可光控释放基因的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层，其特征在于，所述的基底材料为石英玻璃、导电玻璃、钽片、硅片。5.如权利要求1所述的可光控释放基因的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层，其特征在于，所述的纳米金为金纳米颗粒、金纳米棒；金纳米颗粒尺寸为10～100nm，金纳米棒的长径比为2.5～4.5。6.如权利要求1所述的可光控释放基因的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层，其特征在于，纳米金/胶原混合溶液中纳米金的浓度为200～1000μg/ml。7.如权利要求1所述的可光控释放基因的二氧化钛/纳米金/胶原复合涂层，其特征在于，所述的胶原为Ⅰ型胶原，纳米金/胶原混合溶液中胶原浓度为1～3mg/ml。8.制备如权利要求1-7任一项所述的可光控释放...

【专利技术属性】
技术研发人员：程逵，姚利利，翁文剑，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33