基于病毒核酸与miRNA双向共生检测2019-nCoV的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于病毒核酸与miRNA双向共生检测2019-nCoV的方法及试剂盒，属于涉及RNA病毒核酸检测技术领域，其步骤包括：待检测样本病毒RNA裂解；病毒RNA捕获和miRNA捕获；扩增片段双向生成：进行RT反应得到病毒RNA衍生片段和miRNA衍生片段；将病毒RNA衍生片段和miRNA衍生片段进行同步扩增；PCR产物的荧光片段长度多态性分析；本发明专利技术的检测方法精准性高，同一反应中检出3-6重靶标基因，涵盖了目前发布的所有新型冠状病毒的核酸序列并可与普通冠状感冒病毒进行区分；假阳性、假阴性率低；采用内源性miRNA为样本质控指标，检出率高；检测低限10-100个分子，灵敏度高；适用范围广，病毒RNA免提取，适合自动化杂交与扩增，封闭式操作杜绝接触病毒，可有效保证操作人员安全。可有效保证操作人员安全。可有效保证操作人员安全。

【技术实现步骤摘要】
基于病毒核酸与miRNA双向共生检测2019-nCoV的方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及RNA病毒核酸检测
，尤其涉及一种基于病毒核酸与miRNA双向共 生检测2019-nCoV的方法。

技术介绍

[0002]rRT-PCR测定法是确诊患者RNA病毒感染的临床金标准。但受制于qPCR反应原理，无 法克服假阳性、假阴性高的缺点，因此，较难确诊病毒载量低的病人(早期，轻度患者)。 核酸检测整个分析流程中，涉及采样、样本保存运输、核酸提取、实时PCR分析等步骤。
[0003]出现核酸检测假阴性的可能原因很多，包括：1.样本质量(包括取样部位，核酸降解)； 2.样本保存及运输条件(核酸降解)；3.核酸提取质量(核酸丢失、杂质)；4.PCR核酸检测 方法局限(PCR抑制，检测下限为统计平均值-调高检测下限，假阴性率升高；调低，则 假阳性率增加)。
[0004]在2020年爆发的2019-nCoV(也称为“SARS-CoV-2”，也称“新型冠状病毒”)瘟疫的 临床检测实践中，新型冠状病毒rRT-PCR核酸检测结果没有达到预期，是造成大量疑似病 例的主要原因之一。
[0005]JAMA杂志总结了各种检测新型冠状病毒手段的窗口期，以及灵敏度随时间的变化规律。 在病毒感染后，能够最早检出的方法是鼻咽拭子/唾液qPCR核酸检测法，大约在感染后一 周，症状出现前一周就逐渐呈现阳性，且灵敏度较高。但到了发病(症状出现后)3.5周灵 敏度逐渐下降，灵敏度低于BALF和粪便的qPCR核酸检测及抗体检测。而抗体在发病后一 周逐渐呈现阳性，3周后灵敏度达到峰值，而后IgG抗体检测持续保持较高灵敏度，因此， 在前期用鼻咽拭子/唾液qPCR可以有效筛查新发感染，而后期的抗体检测能获得患者感染 史信息。
[0006]如前所述，RNA病毒核酸检测所面临的问题包括：
[0007]1.病毒样本收集：rRT-PCR检测的硬伤，在于对样本的要求很高。阴性结果也不能排除 新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括：样本质量差，比如口咽等部 位的呼吸道样本；样本收集的过早或过晚；没有正确的保存、运输和处理样本；技术本身 存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等。样本稳定性差。
[0008]第五版《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》建议采集口鼻咽组织，下呼吸道采集的 痰、肺泡灌洗液样本、粪便及肛拭子等多部位标本。下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液标本 阳性率高，但采集难度大、易引起患者喷射导致采集操作者感染风险大。本研究比较口罩 内层收集患者飞沫、深咳痰液与常规样本收集方式的优劣。
[0009]鼻咽拭子采集鼻部分泌物，口咽拭子采集咽部和扁桃体分泌物，深咳痰液是由气道远 端咳出的分泌物，支气管分泌物由腺体或局部杯状细胞产生分泌物，唾液为唾液腺产生的 分泌物，采集后用于检测细菌、病毒。通用的样本采集方式必须使棉签深入到鼻腔上部的 更深处(鼻咽处)，才能采集到有效样本。这是一项困难而又不舒服的操作，需要训练
有素 的医疗专业人员的参与，不仅造成被检测者诸多不适，采集者也近距离面对被检测者，有 高传染风险。而这也阻碍了家庭测试的发展。
[0010]2020年4月15日，美国FDA通过了罗格斯大学开发的唾液检测的EUA，只需要吐口水 到检测试剂盒，即可检测是否感染新冠病毒，医务人员和患者可以保持6英尺的距离，确 保没有近距离接触新冠病人。检测过程的安全性大大提高，在全球的检测新冠病毒的方式 中是一项创举。理论上，任何呼吸道传染的病毒均可在唾液中被检查出来，因此，唾液作 为检测样本是非常理想的。
[0011]2、样本灭活：在核酸检测实验室，病毒样本首先需要进行灭活处理，由两名完成三级 防护的工作人员，进入样本处理区或样本处理专用实验室，将接收到的样本二级包装在安 全柜内打开，检查样本主容器是否为严格密闭；对密封袋表面进行消毒后，对送检样本进 行56℃下30分钟的灭活，灭活后的样本管需在生物安全柜内打开最内层的容器，将拭子保 存液混匀后进行分装和用于核酸提取。涉及高致病性病原微生物的实验室活动，需由两名 工作人员完成，其中一人负责主要实验操作，一人提供必要的协助。主操作者需避免反复 多次进出安全柜。这个过程对病毒核酸产生降解，是样本检出率不高的主要来源之一，并 有可能感染操作人员。
[0012]3、样本内源基因：人类细胞中有一类持续高表达的保守基因，如GAPDH、RNaseP等， 常被用作样本保存完整程度及样本量的质控标记，即生物样本内源性质控。内源质控基因 需要在样本中首先被检出，以确认该样本是否合格，保证检测结果的有效性。但是，新冠 检测的无细胞分泌样本，如唾液、痰液、泪液等，缺乏常规表达的mRNA基因，无法提供样 本内源质控标记。
[0013]Rutgers临床基因组学实验室发布了用唾液作为2019-nCoV测试的可行生物样品，与其Perkin Elmer核酸提取和ThermoFisher TaqPath SARS-CoV-2自动化过程相匹配，获得了 美国FDA的紧急使用授权(EUA)的快速批准。该方法可使用Spectrum公司的SDNA-1000 唾液收集装置收集的唾液，但无法设置内源样本质控，只能在RNA提取前，向样本中加入 噬菌体作为质控代替。这会降低检出率并造成潜在的假阳性结果。
[0014]现有研究证实，无细胞分泌物中含有大量的miRNA，其中的一些miRNA，如miR-21， miR-16,Let-7家族成员等，具有广谱的高表达。可以作为这类样本的内源质控指标[1]。但 时由于miRNA(22nt)同病毒核酸大小相差巨大，目前还缺乏能同时检测这两类核酸的实用 技术。
[0015]4、核酸提取：新冠病毒是RNA病毒，单链RNA(约3万个碱基)被病毒外壳蛋白包裹， 与成熟的微小RNA(miRNA，22个碱基)被蛋白包裹的形式一致。病毒RNA为长链RNA，更 容易被捕获和扩增。
[0016]令人关切的是，测定的假阴性结果在2019-nCoV患者病例中相当普遍，专业文章及媒 体中也有诸多报道。一些患者已经出现乏力、肌肉酸痛、干咳、鼻塞等症状，多次咽拭子 检测结果核酸阴性，复查后核酸检验阳性的病例，是目前检测方法假阴性结果的一个例证。 加拿大和美国疾控中心(CDC)也报出多个假阴转“阳”的案例。增加疫情控制难度和成本。
[0017]另外，rRT-PCR核酸检测通常仅能检出标本中是否含有新冠病毒一种病原体，其它病原 体就被忽略了。在感冒季节，非新冠病毒导致的肺炎患者占大部分，造成核酸检测结果与 临床CT结果不符时也不能排除其他病毒引起的肺炎，导致大量疑似病例。理论上讲，
如果 是合格的核酸检测试剂，选择正确的体液样品，核酸检测应该更灵敏。通过CT结果来确诊， 更会导致更多的早期新冠病毒感染患者的漏诊，造成更大的临床诊断混乱，加大管理成本。
[0018]区别核酸检测结果是真阴性还是假阴性，需要从采样方式、样本保存储藏、核酸提取 及检测方法等多方面进行质量控制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于病毒核酸与miRNA双向共生检测2019-nCoV的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）待检测样本病毒RNA裂解；（2）病毒RNA捕获和miRNA捕获；（3）扩增片段双向生成：进行RT反应得到病毒RNA衍生片段和miRNA衍生片段；（4）PCR同步扩增：将病毒RNA衍生片段和miRNA衍生片段进行同步扩增；（5）PCR产物的荧光片段长度多态性分析。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，加入细胞裂解液进行RNA裂解，所述细胞裂解液优选为去污剂，所述去污剂进一步优选为Triton X114。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述待检测样本为唾液、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血清及血浆及其干斑，所述待检测样本优选采用70%-75%酒精进行干燥脱水和灭活。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述miR...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐凯，罗德伦，张耀艺，何欢，吴秀锦，黄健，朱江，彭灵犀，雷颖雪，
申请(专利权)人：成都诺恩基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：