一种基于RPA-LFD法检测非洲猪瘟病毒自然变异株的引物组及方法技术

本发明专利技术公开了一种基于RPA

【技术实现步骤摘要】
一种基于RPA
‑
LFD法检测非洲猪瘟病毒自然变异株的引物组及方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学及免疫学
，具体涉及一种基于RPA
‑
LFD法检测非洲猪瘟病毒自然变异株的引物组及方法。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性、致死性动物传染病，给中国养猪业带来了巨大的经济损失。ASF于2018年传入我国后已流行了3年有余，针对我国ASF疫情放缓以及感染猪出现的低死亡率现象，研究者在ASFV生态学研究中，从主动监测的样品中分离到1株源自湖北某地的ASFV自然变异株。经基因组测序发现，其EP402R基因和上游相邻的EP153R基因出现突变，导致病毒血吸附特性丧失；在多处基因编码区和基因间隔区出现独有的碱基突变、缺失或插入，与国内已经发表的10个ASFV毒株完全不同，这些变化导致病毒蛋白氨基酸组成的改变和功能丧失；该变异株不含任何已知标记基因，说明我国的ASFV已经出现了自然变异株，可能是目前ASF呈现亚急性型流行的原因所在。
[0003]重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是新进兴起的一种新型的恒温核酸扩增技术。其主要原理为模仿T4噬菌体内的核酸复制机制，以重组酶uvsX和单链结合蛋白Gp32在体外恒温条件下实现DNA模板的特异性识别与结合，并通过链置换DNA聚合酶Bsu实现模板DNA的扩增。该技术可在23
‑
45℃下进行反应，反应时间只需5
‑
20min，特异性强，灵敏度高，无需相对严苛的实验室条件，其产品具备快速诊断的能力。
[0004]免疫侧流层析法是目前发展较为成熟的检测技术，多用于抗原或抗体的检测。应用于分子生物学中，金垫包被有带FAM抗体的纳米金球，检测线上包被有亲和素，质控线上包被有抗FAM抗体的抗体。当带有FAM和生物素的PCR阳性产物加入到试纸条时，就会通过抗原抗体结合作用，在检测线上形成亲和素
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PCR产物
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纳米金球复合体沉淀显色。该种方法摆脱了分子生物学检测结果依靠仪器进行观察的弊端，具有广阔的市场前景。
[0005]目前检测非洲猪瘟病毒抗原的国家标准是荧光定量PCR法，普通PCR，荧光免疫法。这些方法都具有局限性，都需要在实验室中使用较为复杂的仪器进行操作。石河子大学等也开发了非洲猪瘟病毒核酸检测的RPA方法，但无法区分经典株、自然变异株、CD2v缺失株、MGF缺失株及CD2v
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MGF双缺株。
[0006]本专利技术采用重组酶聚合酶扩增
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免疫侧流层析(RPA
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LFD)技术，针对非洲猪瘟自然变异株突变的特异序列进行引物设计，实现只针对非洲猪瘟自然变异株的核酸的快速可视化检测。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种基于RPA
‑
LFD法检测非洲猪瘟病毒自然变异株的引物
组及方法，用于非洲猪瘟自然变异株感染的检测。
[0008]本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：
[0009]一种基于RPA
‑
LFD法检测非洲猪瘟病毒自然变异株的引物组，所述引物组包含：5'端用FAM标记的上游引物、以及5'端用生物素标记的下游引物，其基因序列分别为：
[0010]上游引物：5
’‑
FAM
‑
CCACCCAAACCACTACCTAGTAT
‑3’
；
[0011]下游引物：5
’‑
BIOTIN
‑
ATACTAGGTAGTGGTTTGGGTGG
‑3’
。
[0012]进一步改进在于，所述引物组还包括未标记的上游引物、以及下游引物，其基因序列分别为：
[0013]上游引物：5
’‑
CCACCCAAACCACTACCTAGTAT
‑3’
；
[0014]下游引物：5
’‑
ATACTAGGTAGTGGTTTGGGTGG
‑3’
。
[0015]本专利技术还提供了一种基于RPA
‑
LFD法检测非洲猪瘟病毒自然变异株的可视化试剂盒，所述可视化试剂盒包括如权利要求2所述的引物组、以及层析试纸条。
[0016]本专利技术还提供了一种基于RPA
‑
LFD法检测非洲猪瘟病毒自然变异株的可视化检测方法，步骤包括：
[0017](1)制备层析试纸条；
[0018](2)取如权利要求2所述的引物组在RPA体系中进行反应扩增；
[0019](3)将步骤(2)得到的扩增产物滴加于步骤(1)得到的层析试纸条上，进行LFD反应，观察检测结果。
[0020]进一步改进在于，步骤(2)中，所述RPA体系的反应时间为20min，反应温度为30℃，反应环境为气浴。
[0021]进一步改进在于，步骤(3)中，所述LFD反应的反应时间为10min，反应温度为30℃，反应环境为气浴。
[0022]本专利技术的有益效果在于：本专利技术实现了特异性检测非洲猪瘟病毒自然变异株，而非经典株、CD2v缺失株、MGF缺失株及CD2v
‑
MGF双缺株；本专利技术操作简单、检测速度快只需要30min，比其他RPA方法反应时间要短，对反应要求更低。更具价值的是，本专利技术可以在室温下反应，摆脱了实验环境的限制，便于基层实验室及养殖场日常检测及筛查使用。
附图说明
[0023]图1为引物验证电泳图；图中，泳道M：DNA Marker、泳道1：普通引物扩增结果、泳道2：标记了FAM和生物素的引物扩增结果。
[0024]图2为带标记引物不同温度下RPA扩增电泳图；图中，泳道M：DNA Marker、泳道1：20℃条件下扩增结果、泳道2：25℃条件下扩增结果、泳道3：30℃条件下扩增结果。
[0025]图3为带标记引物不同反应时间下RPA扩增电泳图；图中，泳道M：DNAMarker、泳道1：扩增10min条件下扩增结果、泳道2：扩增15min条件下扩增结果、泳道3：扩增20min条件下扩增结果、泳道4：扩增30min条件下扩增结果、泳道5：扩增40min条件下扩增结果。
[0026]图4为RPA
‑
LFD试纸条示意图；图中，1为PVC板，2为样品垫，3为金垫，4为NC膜，5为吸水垫，C为质控线，T为检测线。
[0027]图5为带标记引物RPA扩增特异性检测电泳图；A图中，泳道M:DNA Marker、泳道1：ASFV经典株扩增结果、泳道2：ASFV CD2v缺失株扩增结果、泳道3：ASFV MGF缺失株扩增结
果、泳道4：ASFV C本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于RPA
‑
LFD法检测非洲猪瘟病毒自然变异株的引物组，其特征在于，所述引物组包含：5'端用FAM标记的上游引物、以及5'端用生物素标记的下游引物，其基因序列分别为：上游引物：5
’‑
FAM
‑
CCACCCAAACCACTACCTAGTAT
‑3’
；下游引物：5
’‑
BIOTIN
‑
ATACTAGGTAGTGGTTTGGGTGG
‑3’
。2.根据权利要求1所述的一种基于RPA
‑
LFD法检测非洲猪瘟病毒自然变异株的引物组，其特征在于，所述引物组还包括未标记的上游引物、以及下游引物，其基因序列分别为：上游引物：5
’‑
CCACCCAAACCACTACCTAGTAT
‑3’
；下游引物：5
’‑
ATACTAGGTAGTGGTTTGGGTGG
...

【专利技术属性】
技术研发人员：符修乐，卞传忠，徐前明，
申请(专利权)人：安徽中起生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：