一种广谱抗原虫多肽及其制备与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种广谱抗原虫多肽，其氨基酸序列由转导蛋白结构域序列、linker蛋白序列和突变型APLV4

【技术实现步骤摘要】
一种广谱抗原虫多肽及其制备与应用


[0001]本专利技术涉及基因重组
及药剂
，尤其涉及一种广谱抗原虫多肽及其制备与应用。

技术介绍

[0002]重组蛋白是指应用重组DNA或重组RNA技术而获得的蛋白质。重组蛋白工程先应用基因克隆或化学合成技术获得目的基因，连接到适合的表达载体，导入到特定的宿主细胞，利用宿主细胞的遗传系统，表达出有功能的蛋白质分子。
[0003]细胞穿膜肽是一类能够穿过细胞膜或组织屏障的短肽。细胞穿膜肽可通过内吞和直接穿透等机制运载蛋白质、RNA、DNA等生物大分子进入细胞内发挥其效应功能。相比于其他非天然的化学分子，细胞穿膜肽具有生物相容性佳、对细胞造成的毒性小、并能与生物活性蛋白直接融合重组表达等优点。许多细胞穿膜肽都是来源于某些直接与宿主细胞相互作用的病毒结构蛋白的蛋白转导结构域。
[0004]Apis picorna
‑
like virus 4(APLV4)是一种正链RNA病毒，宿主为蜜蜂和蜂螨，在国内蜂群高发且长期存在。感染该病毒会导致成虫、幼虫和蛹期的显著死亡。除了工蜂、幼虫和蛹的死亡率外，蜂王也会受到直接或间接的影响；在感染APLV4病毒的后期，蜂王体重和产卵量下降。同时该病毒会导致蜂螨的卵、若螨和成螨各阶段的显著死亡。
[0005]原虫是一类原生动物，是异养型单细胞真核微生物，基本结构由表膜、细胞质和细胞核三部分组成，大小为1～150μm，结构简单。但其在长期适应寄生生活的进化过程中，发生了细胞质水平的功能分化，产生了一些特化的细胞器，行使高等动物器官样功能。自17世纪列文虎克首次发现兔斯氏艾美耳球虫以来，已记录原虫逾200000种。原虫无处不在，极地的士壤和水体中都可见其踪影。已知原虫中10000余种营寄生生活，一些原虫是重要病原，可引起动物和人类的一些重要疾病，如疟疾、球虫病、梨形虫病、毛滴虫病等，给人类健康和经济发展造成了巨大伤害。目前的治疗手段主要是硝唑类抗生素。随着禁抗令的实施，抗生素的使用越来越值得关注，且抗生素的使用会导致原虫耐药性的出现。对于养殖企业来说临出栏产品出现原虫病会是非常严重的打击。据此，一种安全的有效的非抗生素类的抗原虫药物，成为广大养殖企业的迫切需求。
[0006]目前，专利CN101048154A公开了一种抗原虫剂，但该药物只针对利士曼原虫，非广谱抗原虫药物，不适合混合感染的条件下使用，而国内养殖的突出问题就是混合感染。因此，CN101048154A公布的方法仍无法满足现阶段国内养殖行业的使用需求。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种广谱抗原虫多肽及其制备与应用，其基于突变型APLV4
‑
VP蛋白以及转导蛋白结构域(作为细胞穿膜肽)进行设计，设计出一种人工的抗原虫多肽，该多肽可用于广谱抗原虫，效果不亚于抗生素类药物且不会导致耐药性。
[0008]本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：
[0009]一种广谱抗原虫多肽，所述广谱抗原虫多肽的氨基酸序列由转导蛋白结构域序列、linker蛋白序列和突变型APLV4
‑
VP蛋白序列顺序连接构成；其中，所述转导蛋白结构域序列为HIV
‑
TAT转导蛋白结构域氨基酸序列；所述linker蛋白序列为柔性linker蛋白氨基酸序列(GGGGS)
n
，n≥1；所述突变型APLV4
‑
VP蛋白序列包括顺序连接的突变型VP4蛋白氨基酸序列和原始VP2、VP3、VP1蛋白氨基酸序列。
[0010]作为本专利技术的优选方式之一，所述HIV
‑
TAT转导蛋白结构域氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述柔性linker蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述突变型APLV4
‑
VP蛋白中，突变型VP4蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，未突变的原始VP2、VP3、VP1蛋白氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、5、6所示，完整的突变型APLV4
‑
VP蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0011]一种上述广谱抗原虫多肽的制备方法，包括如下步骤：
[0012](1)广谱抗原虫多肽基因序列的获得；
[0013](2)工程菌构建；
[0014](3)发酵纯化，获得广谱抗原虫多肽。
[0015]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(1)中广谱抗原虫多肽基因序列的获得，具体获取方法为：
[0016]①
获取转导蛋白结构域序列；
[0017]②
获取突变型APLV4
‑
VP蛋白序列；
[0018]③
使用linker蛋白序列将所述转导蛋白结构域序列和所述突变型APLV4
‑
VP蛋白序列进行连接，得到广谱抗原虫多肽的氨基酸序列；
[0019]④
使用DNAMAN软件，做反向翻译，结合Bacillus subtilis密码子偏好进行优化，并于上游添加酶切位点BamHⅠ，下游添加酶切位点XbaⅠ，得广谱抗原虫多肽的基因序列。
[0020]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中工程菌构建，具体构建方法为：通过内切酶对获得的广谱抗原虫多肽的基因序列及pHT43质粒进行双酶切，将双酶切产物使用T4连接酶连接，挑取阳性单菌落、恒温扩大培养、送检测序合格后获得。
[0021]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(3)中发酵纯化，具体发酵纯化方法为：
[0022]①
取经测序合格的工程菌于摇床37℃、220rpm培养至OD600为2.0；加入3mM的IPTG，随即将摇床的温度调为18℃，诱导12h后收获；于4℃，12000rpm离心15min，取上清弃沉淀；
[0023]②
取离心后上清液1:1加入80％饱和度的(NH4)2SO4；然后将该混合液放于4℃冰箱静置48h，将发酵液中的蛋白絮凝沉淀析出；于4℃、12000rpm离心15min，取沉淀，弃去上清液；用PBS缓冲液对沉淀进行悬浮，并用与悬浮液相同浓度的PBS透析去除盐分；取透析后的蛋白溶液1:1加入80％饱和度的(NH4)2SO4；然后将该混合液放于4℃冰箱静置48h，将混合液中的蛋白絮凝沉淀析出；于4℃，12000rpm离心15min，取沉淀，弃去上清液；用PBS缓冲液对沉淀进行悬浮，并用与悬浮液相同浓度的PBS透析去除盐分即得目的蛋白。
[0024]一种上述广谱抗原虫多肽在动物体内和/或体外抗原虫的应用。
[0025]作为本专利技术的优选方式之一，当动物口服广谱抗原虫多肽后，所述广谱抗原虫多肽在动物体内发挥广谱抗原虫作用。
[0026]作为本专利技术的优选方式之一，当在动物饲养环境中喷洒广谱抗原虫多肽后，所述
广谱抗原虫多肽在动物体外发挥广谱抗原虫作用。
[0027]本专利技术相比现有技术的优点在于：
[0028](1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种广谱抗原虫多肽，其特征在于，所述广谱抗原虫多肽的氨基酸序列由转导蛋白结构域序列、linker蛋白序列和突变型APLV4
‑
VP蛋白序列顺序连接构成；其中，所述转导蛋白结构域序列为HIV
‑
TAT转导蛋白结构域氨基酸序列；所述linker蛋白序列为柔性linker蛋白氨基酸序列(GGGGS)
n
，n≥1；所述突变型APLV4
‑
VP蛋白序列包括顺序连接的突变型VP4蛋白氨基酸序列和原始VP2、VP3、VP1蛋白氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的广谱抗原虫多肽，其特征在于，所述HIV
‑
TAT转导蛋白结构域氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述柔性linker蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述突变型APLV4
‑
VP蛋白的完整氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。3.一种如权利要求1～2任一所述的广谱抗原虫多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)广谱抗原虫多肽基因序列的获得；(2)工程菌构建；(3)发酵纯化，获得广谱抗原虫多肽。4.根据权利要求3所述的广谱抗原虫多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中广谱抗原虫多肽基因序列的获得，具体获取方法为：
①
获取转导蛋白结构域序列；
②
获取突变型APLV4
‑
VP蛋白序列；
③
使用linker蛋白序列将所述转导蛋白结构域序列和所述突变型APLV4
‑
VP蛋白序列进行连接，得到广谱抗原虫多肽的氨基酸序列；
④
使用DNAMAN软件，做反向翻译，结合Bacillus subtilis密码子偏好进行优化，并于上游添加酶切位点BamHⅠ，下...

【专利技术属性】
技术研发人员：符修乐，王雅婷，卞紫昱，卞康胤，汪李天择，汪露露，徐前明，卞传忠，
申请(专利权)人：安徽中起生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：