一种口服重组融合鱼生长素及其PEG化的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种口服重组融合鱼生长素及其PEG化的制备方法和应用，涉及基因重组技术领域及药剂领域，本发明专利技术中的融合鱼生长素的氨基酸序列包括转导蛋白结构域序列、linker蛋白序列和通用鱼生长素氨基酸序列，本发明专利技术采用鱼诺达病毒(Piscinenodavirus，PNV)转导结构域序列、草鱼呼肠孤病毒(Reovirusofgrasscarp，GCRV)转导结构域序列，蛋白激酶受体2(Proteaseactivatedreceptor2，Par2)TMhelix1作为细胞穿膜肽引导生长素进入细胞，提高蛋白转导率，同时采用mPEG

【技术实现步骤摘要】
一种口服重组融合鱼生长素及其PEG化的制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因重组
及药剂领域，具体涉及一种口服重组融合鱼生长素及PEG化重组融合鱼生长素，还涉及一种重组融合鱼生长素及PEG化重组融合鱼生长素制备方法及其在促进鱼类生长中的应用。

技术介绍

[0002]生长素(Growth Hormone，GH)广泛存在于各种脊椎动物中。它是一种具有广泛生理功能的生长调节素，能影响几乎所有的组织类型和细胞，具有促进骨骼生长，氮保留和加速蛋白质合成，并影响葡萄糖和脂类的代谢的功能。由于生长素具有以上功能，人们便利用基因工程技术大量生产重组生长素，将外源生长素注射或作为添加剂投喂动物促进生长。在鱼类养殖业上具有广泛的前景，具有明显的经济效益和社会效益。
[0003]原核表达是蛋白重组的一种方法类别，是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入原核类表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。原核表达的优点在于能够短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。方法也比较简单，可以表达的蛋白也比较多，适合大规模生产工艺。胞内表达是外源蛋白原核表达主要的表达形式。但是由于原核细胞的细胞质环境呈现还原性，不利于蛋白二硫键的形成和稳定，从而导致蛋白的不准确折叠，形成不溶性的包涵体。蛋白质动力学模型研究表明活性蛋白的产率还取决于蛋白的合成速率，折叠速率和聚集速率，当外源蛋白在原核细胞中高效表达时，一旦形成新生肽链的聚集速度超过他的折叠速率就会导致包涵体的形成。
[0004]目前有专利ZL201410650626公布了一种重组罗非鱼生长激素；专利ZL00116393公布了一种鲢鱼生长激素；专利ZL201210189101公布了一种罗非鱼重组口服生长激素；专利ZL202110052253公开了一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白及其制备方法和应用；其中专利ZL201410650626等类似专利均以单一鱼种为基础进行开发，鱼类的生长素差异较大，未进行多种鱼类的适用性设计，且海水养殖的高渗特点会对蛋白的活性产生较大的影响，因此该方案适用鱼种较少；专利ZL201410650626、ZL00116393等未进行口服方式的优化，生长素的吸收率较低；专利ZL201210189101开发的口服生长素使用了HIVⅠ型的转导蛋白，经验证在有胃鱼类上使用时生长素的转导率较低；专利ZL202110052253公开的方法，因其使用脂类会在水面形成油膜，虽然转导率较高但易造成水体污染鱼群缺氧，因而不适合水体养殖使用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的在于提供一种口服重组融合鱼生长素及其PEG化的制备方法和应用，可以有效解决
技术介绍
中的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0007]本专利技术提供一种口服重组融合鱼生长素，所述融合鱼生长素的氨基酸序列由转导蛋白结构域序列、linker蛋白序列和通用鱼生长素氨基酸序列构成，所述转导蛋白结构域
序列包括PNV转导蛋白结构域、GCRV转导蛋白结构域和Par2转导蛋白结构域。
[0008]进一步改进在于，所述PNV转导蛋白结构域氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述GCRV转导蛋白结构域氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述Par2转导蛋白结构域氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述linker蛋白序列如SEQ ID NO.9所示，所述通用鱼生长素氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0009]本专利技术还提供一种上述口服重组融合鱼生长素的制备方法，包括以下步骤：
[0010](1)融合鱼生长素基因序列的获得；
[0011](2)工程菌构建；
[0012](3)发酵纯化后获得融合鱼生长素。
[0013]进一步改进在于，所述融合鱼生长素基因序列的获得具体包括以下步骤：
[0014](1)获取转导蛋白结构域序列；
[0015](2)获取通用鱼生长素氨基酸序列；
[0016](3)使用柔性linker蛋白序列将转导蛋白结构域序列和通用鱼生长素氨基酸序列进行连接，得到融合鱼生长素的氨基酸序列；
[0017](4)使用DNAMAN软件，结合BL21密码子偏好优化，做反向翻译并于上游添加酶切位点NCOⅠ，下游添加酶切位点XhoⅠ，得融合鱼生长素基因序列。
[0018]进一步改进在于，所述通用鱼生长素氨基酸序列通过去除信号肽序列、膜内序列和穿膜序列，分别获得鲤鱼生长素序列、鲈鱼生长素有效序列、鲑鱼生长素有效序列和鲶鱼生长素有效序列后对氨基酸序列进行一致性拼接获得。
[0019]进一步改进在于，所述工程菌构建通过内切酶对融合蛋白基因序列及pET32a质粒进行双酶切，将双酶切产物连接，挑取阳性克隆、恒温培养、测序后获得。
[0020]进一步改进在于，所述发酵纯化具体步骤为：
[0021](1)取经测序合格的工程菌培养，加入IPTG，诱导收获、离心、收集菌体，循环破碎、收集破碎后菌液，离心取沉淀溶解于洗涤缓冲液，搅拌、离心、取沉淀洗涤、捣碎后用溶解缓冲液充分溶解，然后离心取上清即为包涵体溶解产物；
[0022](2)将包涵体溶解产物缓慢加入到4倍体积的复性缓冲液，静置过夜后再置50倍体积透析液透析过夜，离心收上清。
[0023]本专利技术还提供一种上述口服重组融合鱼生长素的PEG化制备方法，包括以下步骤：
[0024](1)取0.5g/mL融合鱼生长素，用MES透析液稀释融合鱼生长素至0.01mM/mL，搅拌后加入EDC固体粉末，溶解完全后加入NHS，充分混匀；
[0025](2)加入β
‑
巯基乙醇、搅拌、灭活EDC，调节pH，加入含0.05g/mL 5K分子量mPEG
‑
NH2的PBS充分混匀，搅拌2h，透析过夜，即得PEG化的融合鱼生长素。
[0026]本专利技术还提供一种上述口服重组融合鱼生长素在促进鱼类生长药剂中的应用。
[0027]本专利技术还提供一种上述制备方法获得的PEG化重组融合生长素在促进鱼类生长药剂中的应用。
[0028]细胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPP)是一类可以介导外源物质穿过细胞膜的小分子多肽。许多CPP都是来源于某些直接与宿主细胞相互作用的病毒结构蛋白的蛋白转导结构域。应用范围最广的细胞穿膜肽来源于人免疫缺陷病毒1型(HIV
‑
1)的转录激活因子(Trans
‑
activating transcription alactivator，Tat)。不管是单独的TAT穿膜肽，
或者是携带其他大分子物质如蛋白质、寡聚核苷酸或脂质体等，在穿膜时都可以表现出较高的穿膜活性。穿膜效率与精氨酸的个数有关，含有6个或者更多精氨酸的多肽要比含有少于5个精氨酸多肽的穿膜效率高一些。
[0029]PEG化即聚乙二醇修饰，是将活化的PEG偶联到蛋白质或多本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种口服重组融合鱼生长素，其特征在于：所述融合鱼生长素的氨基酸序列由转导蛋白结构域序列、linker蛋白序列和通用鱼生长素氨基酸序列构成，所述转导蛋白结构域序列包括PNV转导蛋白结构域、GCRV转导蛋白结构域和Par2转导蛋白结构域。2.根据权利要求1所述的一种口服重组融合鱼生长素，其特征在于：所述PNV转导蛋白结构域氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述GCRV转导蛋白结构域氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述Par2转导蛋白结构域氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述linker蛋白序列如SEQ ID NO.9所示，所述通用鱼生长素氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。3.一种如权利要求1
‑
2任一所述口服重组融合鱼生长素的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)融合鱼生长素基因序列的获得；(2)工程菌构建；(3)发酵纯化后获得融合鱼生长素。4.根据权利要求3所述的一种口服重组融合鱼生长素的制备方法，其特征在于：所述融合鱼生长素基因序列的获得具体包括以下步骤：(1)获取转导蛋白结构域序列；(2)获取通用鱼生长素氨基酸序列；(3)使用柔性linker蛋白序列将转导蛋白结构域序列和通用鱼生长素氨基酸序列进行连接，得到融合鱼生长素的氨基酸序列；(4)使用DNAMAN软件，结合BL21密码子偏好优化，做反向翻译并于上游添加酶切位点NCOⅠ，下游添加酶切位点XhoⅠ，得融合鱼生长素基因序列。5.根据权利要求4所述的一种口服重组融合鱼生长素的制备方法，其特征在于：所述通用鱼生长素氨基酸序列通过去除信号肽序列、膜内序列和穿膜序列，分别获得鲤鱼生长素序列、...

【专利技术属性】
技术研发人员：符修乐，王雅婷，李晨溪，姜纪，陈洪超，卞紫昱，卞康胤，汪李天择，汪露露，徐前明，杨聪山，刘光清，卞传忠，
申请(专利权)人：安徽中起生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：