一种幽门螺旋杆菌卵黄抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种幽门螺杆菌卵黄抗体及其制备方法和应用。本发明专利技术中，幽门螺杆菌卵黄抗体为通过重组幽门螺杆菌CagA

【技术实现步骤摘要】
一种幽门螺旋杆菌卵黄抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因重组
，具体涉及一种幽门螺旋杆菌卵黄抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]原核表达技术是指通过基因克隆技术，将外源目的基因通过构建表达载体并导入原核表达细胞的方法，使其在特定原核生物内表达。其优点在于能够短时间内获得基因表达产物。方法较简单，成本低廉，适合大规模生产。
[0003]卵黄抗体(Immunoglobulin of yolk，IgY)：通过免疫接种产蛋母鸡(或其他产卵动物)，即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗。IgY的性质与哺乳动物的IgG相似。且IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。
[0004]幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是迄今为止科学家所知道的唯一寄生在人类胃粘膜组织的细菌，全世界超过50％的人口感染。自1984年Barry Marshall和Robin Warren发表论文报告他们成功地在胃炎患者胃粘膜组织培养出H.pylori之后，H.pylori很快就被证明是引起胃肠道疾病的重要病原，而且具有高度致癌性，于1994年被世界卫生组织归入一类致癌因子，是目前己知的第一个可致癌的原核生物。而胃癌是一种高度致死性、难以治愈的癌症。在全世界，胃癌每年影响着100万人，每年有超过70万人死于胃癌。目前仍然缺乏有效治疗胃癌的方法和药物；另一方面，由于抗生素耐药性的不断扩散和增强，幽门螺杆菌的防治变得更加复杂。H.pylori作为致病因子的特点虽已得到公认，但有关其致病的分子机制及感染结局多样性的本质仍未阐明，目前研究较为透彻的有：毒力因子、黏附因子及诱导宿主细胞分泌的细胞因子等。在此对本案所用到的致病物质做简单介绍：
[0005]细胞毒素相关基因A蛋白(cytotoxin
‑
associated gene A，CagA)是H.pylori重要的毒力因子之一，可经cag致病岛编码的Ⅳ型分泌系统注入宿主细胞，通过依赖和或独立于磷酸化的机制，与宿主细胞涉及调控细胞生长和运动的多种蛋白相互作用，导致细胞功能异常。CagA基因3
’
端高度变异，依据其序列分为东亚型(EPIYA
‑
ABD)和西方型(EPIYA
‑
ABC)，且EPIYA
‑
ABD致病性更强。
[0006]H.pylori另一个毒力因子，细胞空泡毒素基因(Vacuolating toxin Gene)一直备受关注，其存在于几乎所有H.pylori菌株基因组中，但只有半数的菌株能够表达具有活性的细胞空泡毒素(Vacuolating cytotoxin，VacA)。VacA毒素是H.pylori所独有的一种细胞毒素，可以使细胞的胞质内产生空泡样变性，造成细胞损伤，甚至能够导致细胞死亡。VacA毒素最早是1988年由Leunk等发现，随后证明这种毒素与消化性溃疡发生有着密切关系。VacA基因序列存在多态性，根据VacA基因的不同信号区与中间区变异家族的组合，可以将H.pylori VacA基因分为：s1m1、s1m2、s2m1、s2m2亚型，携带不同VacA基因亚型的H.pylori菌株毒力及致病性不同。主流研究认为，VacA s1m1基因型是菌株致病性的标志可引起严重
的上皮细胞损伤、消化性溃疡、肠上皮化生和胃癌。
[0007]血型抗原结合黏附素(blood group antigen binding adhesion，babA)是目前为止的研究最为明确的黏附素之一，它能与胃上皮细胞表面岩藻糖基化的Lewisb血型抗原结合而介导H.pylori与胃上皮细胞的黏附，从而增强H.pylori在胃黏膜上定植的能力。babA有两个等位基因，babA1与babA2，只有babA2具有生物活性。babA2阳性的H.pylori菌株不仅在胃黏膜上的定植密度明显高于babA2阴性的菌株，而且与胃黏膜粒细胞、淋巴细胞的浸润及IL
‑
8的水平密切相关。在H.pylori所致的胃黏膜局部免疫炎症反应中具有重要作用。
[0008]尿素酶(urease，Ure)可以催化尿素水解为氨和二氧化碳，氨遇水呈弱碱性。在人体胃内，H.pylori通过不停地利用食物等处的尿素所分解的氨，在其周围形成弱碱的微环境，从而维持其在胃内大的酸性环境下生存，因此，尿素酶成为H.pylori在胃内重要的毒力相关因子及定植因子。尿素酶主要由尿素酶A(UreA)和尿素酶B(UreB)两个亚基构成，其中的UreB作为保护性抗原被认为是疫苗的候选抗原。Zeng等通过3年的跟踪研究，发现以基于UreB的疫苗(NCT02302170)对儿童人群具有良好的保护效能(71.8％)。然而，有研究表明UreB可能发挥双重功能，即在介导免疫保护的同时也具有免疫负调功能。
[0009]目前国家药品监督管理局网站上未检索出有幽门螺杆菌抗体类治疗剂的申报记录及获批记录，即目前尚未有获批的幽门螺杆菌抗体类治疗剂。现有两类技术一类为幽门螺杆菌全菌破碎或提取破碎产物部分成分免疫家禽获得卵黄抗体，另一类是重组单一成分或融合细菌毒素免疫家禽获得卵黄抗体。第一类使用全菌破碎或部分成分的现有技术基本上使用的是临床菌株，该方法存在两大问题：
①
临床菌株的适应性问题，是否为强毒株有待考证。
②
幽门螺杆菌的培养较为困难且成本较高，很难获得满足大规模生产用的足够浓度足够量的抗原。第二类使用重组单一成分或融合细菌毒素的现有技术多使用标准菌株，标准菌株与我国感染致病性的强毒株存在较大的差异，且单一成分的免疫效果不理想，融合细菌毒素的方法也未考虑到幽门螺杆菌的感染亚型。以上两类现有技术所制备的卵黄抗体应对国内幽门螺杆菌的强毒株如东亚株免疫效果低下，无法应用于临床的预防及治疗。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于提供一种幽门螺杆菌卵黄抗体及其制备方法和应用，用于幽门螺杆菌感染的治疗。
[0011]本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：
[0012]一种重组幽门螺杆菌CagA
‑
VacA
‑
babA
‑
Ure蛋白，所述蛋白是由幽门螺杆菌细胞毒素CagA、细胞空泡毒素VacA、血型抗原结合黏附素babA、尿素酶Ure四种蛋白经刚性linker连接而成的融合蛋白。
[0013]进一步改进在于，所述细胞毒素CagA为EPIYA
‑
ABD亚型，所述细胞空泡毒素VacA为s1m1亚型，所述血型抗原结合黏附素babA为babA2亚型，所述尿素酶Ure为UreB亚单位。
[0014]进一步改进在于，所述刚性linker的氨基酸序列为APAPAPAPAPAPAP和EAAAKEAAAKEAAAK。
[0015]本专利技术还提供了一种如权利要求1所述重组幽门螺杆菌CagA
‑
VacA
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组幽门螺杆菌CagA
‑
VacA
‑
babA
‑
Ure蛋白，其特征在于，所述蛋白是由幽门螺杆菌细胞毒素CagA、细胞空泡毒素VacA、血型抗原结合黏附素babA、尿素酶Ure四种蛋白经刚性linker连接而成的融合蛋白。2.根据权利要求1所述的一种重组幽门螺杆菌CagA
‑
VacA
‑
babA
‑
Ure蛋白，其特征在于，所述细胞毒素CagA为EPIYA
‑
ABD亚型，所述细胞空泡毒素VacA为s1m1亚型，所述血型抗原结合黏附素babA为babA2亚型，所述尿素酶Ure为UreB亚单位。3.根据权利要求1所述的一种重组幽门螺杆菌CagA
‑
VacA
‑
babA
‑
Ure蛋白，其特征在于，所述刚性linker的氨基酸序列为APAPAPAPAPAPAP和EAAAKEAAAKEAAAK。4.一种如权利要求1所述重组幽门螺杆菌CagA
‑
VacA
‑
babA
‑
Ure蛋白的制备方法，其特征在于，步骤包括：步骤一、取幽门螺杆菌CagA EPIYA
‑
ABD亚型氨基酸序列、VacAs1m1亚型氨基酸序列、babA2亚型氨基酸序列、UreB氨基酸序列，四段氨基酸序列使用刚性linker连接在一起，形成目的蛋白氨基酸序列，反...

【专利技术属性】
技术研发人员：符修乐，卞传忠，
申请(专利权)人：安徽中起生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：