非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸及方法技术

本发明专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸及方法，属于非洲猪瘟病毒抗体的检测领域，其中所述试纸的结合垫为包被有兔抗鸡IgG‑胶体金复合物的胶体金垫，所述试纸的硝酸纤维素膜上设有由山羊抗兔IgG包被的质控线和ASFV重组抗原包被的检测线。该试纸条与现有技术相比，可迅速检测ASFV IgY抗体水平，本发明专利技术为了提高检测的灵敏度和线性范围，特制备了2种纯化的ASFV重组抗原，相比较其它常规ELISA抗体检测或胶体金检测方法，本发明专利技术更加的方便快捷，灵敏度更高。

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸及方法
本专利技术涉及非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体的快速检测
，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸及方法。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是一种具有高度传染性的猪病毒病。在家猪中可导致接近100％的高死亡率。ASF是由非洲猪瘟病毒(ASFVirus，ASFV)引起，ASFV是一种较大的双链DNA病毒，主要在巨噬细胞的细胞质中复制，ASFV是Asfarviridae科Asfivirus属唯一的成员。ASFV的天然宿主包括野猪和Ornithodoros属的节肢动物媒介。ASFV在其储存宿主的感染通常是无症状的，并且发展为持续感染。相反，ASFV对家猪的感染可导致致命的出血热。非洲猪瘟病毒最大的特性就是“两高”：高传染和高死亡。猪场一旦被感染非洲猪瘟病毒，很快就会向四周蔓延，染病的生猪死亡率达100％，无一幸免。非洲猪瘟一般是通过检测手段才能发现，肉眼辩识并不一定准确。在感染了该病毒的猪体内，其五脏、血液和粪便都有病毒的生存。现阶段对于这种病毒的灭杀还具有很大的难度，至今还没有特效药能够有效的消灭它，其相应的接种疫苗也没有成熟，还不能临床应用。胶体金免疫层析技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。它是继传统三大免疫标记技术之后又一较为成熟的、得到广泛应用的免疫标记技术。当待测样品加入到样品膜上后，由于微孔滤膜的毛细管作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，检测一般只要5～10min就会出结果，相比其它方法(如ELISA需1～2h，荧光定量PCR法需要2小时)大大的缩短了检测时间。其测试结果以肉眼可见的显色条带来判断，不需要特别仪器设备，只需要试纸条或渗滤试剂盒，样品只要做非常简单的处理或不需要做前处理。且具有成本较低、操作简单、试剂稳定不受温度等外界因素影响、方便快捷、特异敏感、稳定性强、结果判断直观等优点，因而特别适合于现场快速检查，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景，代表了诊断试剂简单快速、便于普及的发展方向。中国专利文献CN201920618571.X公开了一种非洲猪瘟抗体胶体金检测卡，所述检测卡包括检测试纸，检测试纸包括PVC底板、及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合垫、全血膜、硝酸纤维素膜和吸水垫，结合垫上包被有胶体金标记的非洲猪瘟重组抗原，硝酸纤维素膜上依次设有检测线、半对照线、对照线和质控线，所述检测线、半对照线和对照线上包被非洲猪瘟病毒重组抗原，所述质控线上包被兔抗金黄色葡萄球菌A多克隆抗体。中国专利文献CN201310197035.4公开了一种非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸条制备方法，并具体公开了用胶体金颗粒标记纯化p54重组抗原，以金黄色葡萄球菌A蛋白作为检测线，以p54免疫血清作为质控线，制备胶体金免疫层析试纸条。以上专利技术仅能定性检测猪体内是否有该抗体，而不能定量检测出该抗体的含量是否已经达到抵抗病毒的滴度，无法判断猪体内的抗体是否足以抵抗非洲猪瘟病毒。本专利技术制备2种纯化的ASFV重组抗原ASFV-1和ASFV-2，混合使用后，不仅能定性检测非洲猪瘟病毒，而且能够提高检测的灵敏度和检测范围，抗体浓度在50ng/ml-800ng/ml还有很高的检测线，明显提高了检测线性范围。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于为了解决上述问题而提供一种新的针对非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸及其制备方法，以提高非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测的灵敏度和线性范围。本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：本专利技术提供了一种非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸，包括PVC底板，及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述结合垫为包被有兔抗鸡IgG-胶体金复合物的胶体金垫，所述硝酸纤维素膜上设有由山羊抗兔IgG包被的质控线和ASFV重组抗原包被的检测线。作为本专利技术的进一步优化方案，所述检测线包括2种ASFV重组抗原。本专利技术还提供了上述非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体试纸的制备方法，包括以下步骤：(1)制备纯化的ASFV重组抗原；(2)制备硝酸纤维素膜：将山羊抗兔IgG和纯化的ASFV重组抗原分别稀释后，包被在硝酸纤维素膜的质控线和检测线上；(3)制备胶体金；(4)胶体金标记兔抗鸡IgG：取兔抗鸡IgG，将胶体金与兔抗鸡IgG混合，离心，用PBS溶液重悬沉淀，获得兔抗鸡IgG-胶体金复合物；(5)制备胶体金垫：将兔抗鸡IgG-胶体金复合物均匀喷在结合垫上，充分干燥，获得胶体金垫；(6)样品垫的处理：将样品垫浸泡在20mmol/L的PBS缓冲液中2-5小时，并且边震荡边混匀，其中缓冲液中加入活化剂，活化剂选用PEG6000、PEG8000、曲拉通100中的一种，终浓度为1％～2％质量百分比，活化剂用量一般为1％～2％的PEG6000、PEG8000、曲拉通100中的一种。；浸泡结束后，将样品垫放入烘箱中烘干；(7)组装：在干燥环境下，将样品垫、胶体金垫、包被好的硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴在PVC板上，裁切后，获得试纸。作为本专利技术的进一步优化方案，所述步骤(1)包括制备2种纯化的ASFV重组抗原ASFV-1和ASFV-2，步骤包括：根据已知的ASFVN-1、N-2蛋白基因序列制备ASFVN蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌进行发酵表达并离心获得菌体，将菌体超声破碎，离心后取上清，将上清液过亲和层析柱，即为纯化的ASFV-1重组抗原。作为本专利技术的进一步优化方案，所述步骤(2)中，山羊抗兔IgG和纯化的ASFV重组抗原分别以25-80mmol/L的Tris缓冲液稀释至终浓度为1mg/ml，再以0.75μL/cm的喷量喷施包被在质控线和检测线上，充分干燥。作为本专利技术的进一步优化方案，所述步骤(3)中，制备胶体金的方法为柠檬酸三钠还原法，步骤包括：(Ⅰ)取质量分数为0.005％-0.015％的HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸；(Ⅱ)迅速加入质量分数为0.5％-5％的柠檬酸三钠水溶液1ml，继续煮沸，溶液由淡黄色变成灰色，继而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，制成胶体金溶液。作为本专利技术的进一步优化方案，所述步骤(4)中，胶体金标记兔抗鸡IgG的步骤包括：(i)取兔抗鸡IgG溶于0.1-0.2ml10mM的缓冲液中，将胶体金溶液的pH值调至7.2；(ii)每20-50mg兔抗鸡IgG中，加入10ml胶体金溶液；(iii)混合3-5min后，加入质量分数为0.05％的BSA，室温作用结合15min；(iv)先2000r/min低速离心15min，再12000r/min高速离心25min；(v)用100mmol/L的pH7.8的含0.2％质量分数Proclin300的缓冲液重悬沉淀，获得兔抗鸡IgG-胶体金复合物。作为本专利技术的进一步优化方案，所述缓冲液为Tri本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸，包括PVC底板，及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫为包被有兔抗鸡IgG-胶体金复合物的胶体金垫，所述硝酸纤维素膜上设有由山羊抗兔IgG包被的质控线和ASFV重组抗原包被的检测线。/n

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸，包括PVC底板，及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫为包被有兔抗鸡IgG-胶体金复合物的胶体金垫，所述硝酸纤维素膜上设有由山羊抗兔IgG包被的质控线和ASFV重组抗原包被的检测线。


2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸，其特征在于，所述检测线包括2种ASFV重组抗原。


3.一种如权利要求1-2任一所述的非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备纯化的ASFV重组抗原；
(2)制备硝酸纤维素膜：将山羊抗兔IgG和纯化的ASFV重组抗原分别稀释后，包被在硝酸纤维素膜的质控线和检测线上；
(3)制备胶体金；
(4)胶体金标记兔抗鸡IgG：取兔抗鸡IgG，将胶体金与兔抗鸡IgG混合，离心，用PBS溶液重悬沉淀，获得兔抗鸡IgG-胶体金复合物；
(5)制备胶体金垫：将兔抗鸡IgG-胶体金复合物均匀喷在结合垫上，充分干燥，获得胶体金垫；
(6)样品垫的处理：将样品垫浸泡在20mmol/L的PBS缓冲液中2-5小时，并且边震荡边混匀，其中缓冲液中加入活化剂；浸泡结束后，将样品垫放入烘箱中烘干；
(7)组装：在干燥环境下，将样品垫、胶体金垫、包被好的硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴在PVC板上，裁切后，获得试纸。


4.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括制备2种纯化的ASFV重组抗原ASFV-1和ASFV-2，步骤包括：根据已知的ASFVN-1、N-2蛋白基因序列制备ASFVN蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌进行发酵表达并离心获得菌体，将菌体超声破碎，离心后取上清，将上清液过亲和层析柱，即为纯化的ASFV-1重组抗原。


5.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，山羊抗兔IgG和纯化的ASFV重组抗原分别以25-80mmol/L的Tris缓冲液稀释至终浓度为1mg/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：卞传忠，
申请(专利权)人：安徽中起生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34