DC细胞表达的mesothelin-ODC422-461融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种DC细胞表达的mesothelin

【技术实现步骤摘要】
DC细胞表达的mesothelin
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ODC422
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461融合蛋白及其应用


[0001]本专利技术属于生物基因领域，尤其涉及一种DC细胞表达的mesothelin
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ODC422
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461融合蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]肿瘤治疗中因肿瘤微环境及肿瘤引起的免疫抑制状态，免疫系统难以对肿瘤抗原进行识别并进行抗原的有效递呈，对肿瘤抗原的降解，可增强肿瘤抗原的免疫原性，激活患者自身的免疫系统，诱导机体细胞免疫和体液免疫应答，从而达到清除肿瘤的目的。
[0003]以往的肿瘤疫苗研究以通过激活患者自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。mesothelin抗原作为肿瘤相关性抗原，其免疫性和抗原性存在差异，有些不能够高效刺激T细胞产生免疫反应，有些难以与T细胞结合进而不能够被有效递呈。

技术实现思路

[0004]本专利技术为了解决上述现有技术中存在的缺陷和不足，提供了一种能够快速实现对mesothelin蛋白的降解，从而更加容易实现免疫细胞对抗原的识别，介导更加强烈的免疫反应，实现更加高效快速的免疫应答的DC细胞表达的mesothelin
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ODC422
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461融合蛋白及其应用。
[0005]本专利技术的技术方案：一种DC细胞表达的mesothelin
‑<br/>ODC422
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461融合蛋白，为由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白；并由mesothelin蛋白与小鼠鸟氨酸脱羧酶C
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422
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461位的氨基酸融合而成，DC细胞的来源包括PBMC中monocyte分化成的DC细胞、iPS/ES诱导分化而成的DC细胞、血液中分离的原代DC细胞。
[0006]优选地，小鼠鸟氨酸脱羧酶（MODC）C
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末端的氨基酸包含一个PEST序列的降解域，这个降解域促进该蛋白的降解，使蛋白的半衰期很短；通过基因工程将含有重组mesothelin
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ODC
422
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461
序列通过慢病毒载体表达在巨噬细胞上，改造使巨噬细胞表达mesothelin
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ODC
422
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461
融合蛋白；当DC细胞表达出抗原后，mesothelin
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ODC
422
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461
融合蛋白存在的时间与半衰期大大缩短，在DC细胞表达体系内能够诱导性瞬时表达；mesothelin能够迅速被降解为小的抗原片段，更易被抗原递呈细胞包括树突状细胞等摄取后加工和递呈给CD4+T细胞或CD8+T细胞，刺激其合成IL
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2，增殖分化为对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用的CTL，完成对肿瘤细胞的有效杀伤，起到肿瘤疫苗的作用。
[0007]优选地，mesothelin
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ODC422
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461融合蛋白的具体融合过程如下：构建mesothelin
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ODC
422
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461
表达系统，将编码mesothelin
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ODC
422
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461
序列的基因导入载体，通过细胞的表达系统合成融合蛋白, 融合蛋白具有降解肿瘤抗原的作用从而诱导特异免疫应答，mesothelin
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ODC
422
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461
融合蛋白表达成功后，将刺激机体通过蛋白质翻译产生抗原本身，起
到肿瘤疫苗的作用；将构建成功的mesothelin
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ODC
422
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461
重组质粒通过慢病毒载体导入iPS细胞中，令iPS定向诱导分化为DC细胞表达mesothelin
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ODC422
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461融合蛋白，并鉴定阳性。
[0008]优选地，ODC
422
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461
是一种独特的氨基酸降解域，该降解域与mesothelin蛋白进行融合后能够促进该蛋白的降解，从而形成小的抗原片段，更易被免疫细胞呈递后诱发免疫应答，加速清除肿瘤。
[0009]一种DC细胞表达的mesothelin
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ODC422
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461融合蛋白的应用，该融合蛋白在药物筛选及淋巴瘤、肉瘤、实体瘤治疗中的应用；第一阶段：分析ODC1425
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461（SEQ ID NO.3）介导的MSLN蛋白降解情况；第二阶段：通过慢病毒载体将mesothelin
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ODC
422
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461
基因序列转入iPS；第三阶段：iPS分化为DC细胞；第四阶段：测定T细胞激活。
[0010]优选地，第一阶段的具体过程如下：将含有双分子荧光载体pCO26，含有MSLN
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0DC1425
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461融合蛋白（SEQ ID NO.1）和pCO32，含有MSLN蛋白（SEQ ID NO.2）瞬转至12孔板中的HEK 293T细胞，24h后随机抽取10个细胞样本群体，每个样本细胞数大于100；在倒置荧光显微镜10倍镜下，对同一视野的细胞样本群体分别进行绿色荧光和红色荧光拍照，利用ImageJ对图片进行荧光强度分析，根据载体设计策略，在绿色荧光强度相同条件下，比较红色荧光强度的大小，计算相对荧光强度，进而来分析ODC1425
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461（SEQ ID NO.3）介导的MSLN蛋白降解情况。
[0011]优选地，第二阶段的具体过程如下：慢病毒生产通过转染293T
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17细胞产生慢病毒颗粒；转染后36和60小时收获病毒，并在23,000r.p.m通过超速离心浓缩；在4
°
C下放置2h 15min；感染培养基为补充有Polybrene的EHT培养基，8微克ml
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1，Sigma；慢病毒感染总量为250μl，24孔板；iPS在旋转接种过程中很容易受到损害，因此感染是静置12h，然后向其中添加250μl新鲜EHT培养基稀聚乙烯；将平行孔再培养3天以进行测量细胞百分比的感染效率，实现感染效率的30
–
70％。
[0012]优选地，第三阶段的具体过程如下：转移至细胞培养瓶中, 置于 37 ℃、5 %CO2 孵箱中孵育 2 小时；弃去上层未贴壁的淋巴细胞, 用预温至37℃的PBS将残余液体洗去, 在培养瓶中加入含有IL
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4( 1000 U/ml) 、GM
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CSF(1000 U/ml) 和 10%小牛血清的 RPMI164本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DC细胞表达的mesothelin
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ODC422
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461融合蛋白，其特征在于：其为由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白；并由mesothelin蛋白与小鼠鸟氨酸脱羧酶C
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422
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461位的氨基酸融合而成，DC细胞的来源包括PBMC中monocyte分化成的DC细胞、iPS/ES诱导分化而成的DC细胞、血液中分离的原代DC细胞。2.根据权利要求1所述的一种DC细胞表达的mesothelin
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ODC422
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461融合蛋白，其特征在于：小鼠鸟氨酸脱羧酶（MODC）C
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末端的氨基酸包含一个PEST序列的降解域，这个降解域促进该蛋白的降解，使蛋白的半衰期很短；通过基因工程将含有重组mesothelin
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ODC
422
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461
序列通过慢病毒载体表达在巨噬细胞上，改造使巨噬细胞表达mesothelin
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ODC
422
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461
融合蛋白；当DC细胞表达出抗原后，mesothelin
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ODC
422
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461
融合蛋白存在的时间与半衰期大大缩短，在DC细胞表达体系内能够诱导性瞬时表达；mesothelin能够迅速被降解为小的抗原片段，更易被抗原递呈细胞包括树突状细胞等摄取后加工和递呈给CD4+T细胞或CD8+T细胞，刺激其合成IL
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2，增殖分化为对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用的CTL，完成对肿瘤细胞的有效杀伤，起到肿瘤疫苗的作用。3.根据权利要求1所述的一种DC细胞表达的mesothelin
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ODC422
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461融合蛋白，其特征在于：其具体融合过程如下：构建mesothelin
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ODC
422
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461
表达系统，将编码mesothelin
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ODC
422
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461
序列的基因导入载体，通过细胞的表达系统合成融合蛋白, 融合蛋白具有降解肿瘤抗原的作用从而诱导特异免疫应答，mesothelin
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ODC
422
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461
融合蛋白表达成功后，将刺激机体通过蛋白质翻译产生抗原本身，起到肿瘤疫苗的作用；将构建成功的mesothelin
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ODC
422
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461
重组质粒通过慢病毒载体导入iPS细胞中，令iPS定向诱导分化为DC细胞表达mesothelin
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ODC422
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461融合蛋白，并鉴定阳性。4.根据权利要求3所述的一种DC细胞表达的mesothelin
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ODC422
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461融合蛋白，其特征在于：ODC
422
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461
是一种独特的氨基酸降解域，该降解域与mesothelin蛋白进行融合后能够促进该蛋白的降解，从而形成小的抗原片段，更易被免疫细胞呈递后诱发免疫应答，加速清除肿瘤。5.一种如权利要求4所述的DC细胞表达的mesothelin
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ODC422
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【专利技术属性】
技术研发人员：戴滨阳，张进，茹欢委，
申请(专利权)人：赛元生物科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：