一种通用供体干细胞及其制备方法技术

本发明专利技术公开了通用供体干细胞及其制备方法。本发明专利技术公开的通用供体干细胞可用于克服基于细胞的移植疗法中的免疫排斥，具体地，本发明专利技术公开的通用供体干细胞不表达MHC‑I和MHC‑II（或HLA‑I和HLA‑II），从而使得干细胞具有低免疫原性。

A general donor stem cell and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种通用供体干细胞及其制备方法
本专利技术涉及一种干细胞领域，具体地涉及一种通用供体干细胞及其制备方法。
技术介绍
多能干细胞具有巨大的治疗潜力。这些未分化的细胞可以产生几乎任何特化的细胞类型，作为受损组织的天然修复系统，或作为可进一步设计用于治疗疾病的新型治疗剂。科学家利用干细胞的独特性质来治疗与死亡或受损细胞相关的疾病。目前，在欧洲，每年有26000名患者接受干细胞治疗来治疗血液疾病和一些癌症，包括白血病。然而，目前人类供体是干细胞的主要来源，由于患者免疫系统的排斥而限制了治疗的成功。目前，干细胞生物学的最新进展使人们有可能考虑将患者自身细胞用作移植的无限源。不幸的是，就多能性、表观遗传状态、分化能力和基因组稳定性而言，iPSC的产生仍然是昂贵的，耗时且高度可变的过程。此外，发现在重编程和长时间培养期间发生的变化引发适应性免疫应答，导致甚至自体干细胞衍生的移植物的免疫排斥。目前已有一些重要的证据支持了HLA-工程细胞将正常运作并避免移植后的异体排斥。(1)HLAI类阴性或HLAII类阴性的罕见个体相对健康，表明HLA阴性细胞可分化成所有必需器官。(2)缺乏主要组织相容性复合体(MHC)I类和II类抗原(HLA的鼠类等同物)的小鼠已经被广泛研究并且除了缺少CD4+和CD8+T细胞外是健康的。重要的是，移植实验已经表明，来自I型阴性小鼠供体的器官或细胞在同种异体受体(包括肝细胞，肾脏，心脏和胰岛)中存活更长时间(有时持续无限期)。这些小鼠实验表明在许多用于多能干细胞的临床环境中，HLA工程化人细胞也将比同种异体细胞存活更长时间。每个人都有一套独特的人类白细胞抗原(HLA)——细胞表面蛋白标志物，向免疫系统发出信号，表明他们是个体自身的细胞。在人群中，编码HLA分子的基因是高度可变的——意味着每个人都有特定的HLA分子条形码，这些条形码是为他们的免疫系统定制的。HLA分为Ⅰ类和Ⅱ，在异体移植中，多种HLAI类和II类蛋白质必须与同种异体受者的组织相容性匹配。I类和II类分子都由两部分组成。I类分子是在高变异HLAI类蛋白与另一种称为β-2-微球蛋白(β-2-微球蛋白)的蛋白结合时形成的，后者是HLA分子到达细胞表面所必需的。当两个高变性HLAII类分子结合在一起时，HLAII类分子到达细胞表面。这两种类型的HLA分子都具有将其它蛋白质片段呈递给免疫系统的作用。所以，敲除主要组织相容性复合体MHCI和MHCII(或HLAI和HLAII)来降低细胞的免疫原性，以避免分化成免疫细胞后宿主对移植细胞产生排斥反应，从而实现异体移植。
技术实现思路
为了克服这种免疫障碍，本专利技术的一方面提供一种通用供体干细胞，所述干细胞相对于野生型干细胞，MHCI和MHCII的表达受调节。在本专利技术中，MHCI和MHCII不表达是由于编码MHCI和MHC的基因的转录调节因子的表达受调节。在本专利技术中，所述干细胞相对于野生型干细胞，还包含至少一个致耐受性因子的表达受调节。在本专利技术的实施方案中，所述转录调节因子的表达受调节是指表达降低。在本专利技术的实施方案中，所述转录调节因子的表达受调节是指表达受抑制。在本专利技术的实施方案中，所述转录调节因子的表达受调节是指转录调节因子缺失。在本专利技术的实施方案中，所述转录调节因子选自B2M、CIITA、RFXANK、RFX5和RFXP中的至少一种。在本专利技术的优选实施方案中，所述调节因子为B2M和RFXANK。在本专利技术的实施方案中，所述致耐受性因子的表达受调节是指表达增加。在本专利技术的实施方案中，所述致耐受性因子抑制免疫排斥。在本专利技术的实施方案中，所述致耐受性因子选自HLA-C、HLA-E、HLA-G、PD-L1、CTKA-4-Ig、CD47和IL-35中的至少一种。在本专利技术的实施方案中，所述致耐受性因子为HLA-E。在本专利技术的实施方案中，所述干细胞还包括自杀基因的表达或表达升高。在本专利技术的实施方案中，所述自杀基因为iCaspase基因。在本专利技术的实施方案中，所述干细胞选自胚胎干细胞、多能干细胞、人类干细胞。本专利技术的另一方面提供一种制备通用供体干细胞的方法，在分离的细胞中，包括以下步骤：(1)调节MHCI和MHCII的表达；(2)调节致耐受性因子的表达。在本专利技术的实施方案中，所述调节MHCI和MHCII的表达是指降低MHCI和MHCII的表达。在本专利技术的实施方案中，所述调节MHCI和MHCII的表达是指抑制MHCI和MHCII的表达。在本专利技术的实施方案中，所述调节MHCI和MHCII的表达是指干扰MHCI和MHCII的表达。在本专利技术的实施方案中，所述调节MHCI和MHCII的表达是通过缺失编码MHCI和MHCII的基因的转录调节因子来实现的。在本专利技术的实施方案中，所述缺失编码MHCI和MHCII的基因的转录调节因子是通过基因敲除来实现的。在本专利技术的实施方案中，所述基因敲除是指转录调节因子的一对等位基因的敲除。在本专利技术的实施方案中，所述转录调节因子选自B2M、CIITA、RFXANK、RFX5和RFXP中的至少一种。在本专利技术的优选实施方案中，所述调节因子为B2M和RFXANK。在本专利技术的实施方案中，所述调节致耐受性因子的表达是指增加致耐受性因子的表达。在本专利技术的实施方案中，所述增加致耐受性因子的表达是指插入致耐受性因子。在本专利技术的实施方案中，所述插入致耐受性因子是通过基因敲入的方式来实现的。在本专利技术的实施方案中，所述致耐受性因子选自HLA-C、HLA-E、HLA-G、PD-L1、CTKA-4-Ig、CD47和IL-35中的至少一种。在本专利技术的实施方案中，利用CRISPRCas9技术进行基因敲除或基因敲入。在本专利技术的实施方案中，所述CRISPRCas9技术包括向导RNA和Cas蛋白，所述向导RNA特异性结合靶向基因的特定序列。在本专利技术的实施方案中，靶向B2M基因的向导RNA序列如SEQIDNO:1-3所示。在本专利技术的实施方案中，靶向RFXANK基因的向导RNA序列如SEQIDNO:22-24所示。在本专利技术的实施方案中，通过将向导RNA，或者编码向导RNA的DNA，以及编码Cas蛋白的核酸，或者Cas蛋白本身引入至细胞完成所述基因敲除或基因调入。在本专利技术的实施方案中，所述向导RNA可以是crRNA和tracrRNA的双链RNA形式，也可以是单链的RNA形式。在本专利技术的实施方案中，所述Cas蛋白为Cas9蛋白。在本专利技术的实施方案中，所述制备通用供体干细胞的方法还包括增加自杀基因表达的步骤。在本专利技术的实施方案中，所述自杀基因为iCaspase基因。本专利技术的有益效果本专利技术提供的通用供体干细胞具有多能性，能够分化成各种细胞，以治疗疾病，并且不会被接受者的免疫系统拒绝。附图说明图1显示了靶向B2M基因的三条sgRNA的相对位置。...

【技术保护点】
1.一种通用供体干细胞，其特征在于，相对于野生型干细胞，所述干细胞的MHC I和MHCII不表达或表达降低，优选地，MHC I和MHC II不表达是由于编码MHC I和MHC的基因的转录调节因子不表达或表达降低；更优选地，所述干细胞还包含至少一个致耐受性因子的表达或表达升高。/n

【技术特征摘要】
1.一种通用供体干细胞，其特征在于，相对于野生型干细胞，所述干细胞的MHCI和MHCII不表达或表达降低，优选地，MHCI和MHCII不表达是由于编码MHCI和MHC的基因的转录调节因子不表达或表达降低；更优选地，所述干细胞还包含至少一个致耐受性因子的表达或表达升高。


2.根据权利要求1所述的通用供体干细胞，其特征在于，所述转录调节因子选自B2M、CIITA、RFXANK、RFX5和RFXP中的至少一种。


3.根据权利要求1所述的通用供体干细胞，其特征在于，所述转录调节因子为B2M和RFXANK。


4.根据权利要求1所述的通用供体干细胞，其特征在于，所述致耐受性因子选自HLA-C、HLA-E、HLA-G、PD-L1、CTKA-4-Ig、CD47和IL-35中的至少一种。


5.根据权利要求1-4任一所述的通用供体干细胞，其特征在于，相对于野生型干细胞，还包括自杀基因表达或表达升高，优选地，所述自杀基因为iCaspas...

【专利技术属性】
技术研发人员：张进，
申请(专利权)人：赛元生物科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33