靶向间充质干细胞药物递送系统的制备方法及其应用技术方案

本发明专利技术公开了靶向间充质干细胞药物递送系统的制备方法及其应用，S1：采集干细胞；S2：检测细胞；S3：制作转染混合液；S4：间充质干细胞预处理；S6：碱性培养。本发明专利技术中的间充质干细胞来源广泛，可以是自体的，也可以是异体的，来源充足，细胞的增殖、存活、分化、迁移、合成与分泌因子等各方面能力优良，无伦理问题、免疫原性低，应用前景广阔。本发明专利技术公开的组织损伤靶向间充质干细胞可以高效定植于组织损伤部位，避免血流冲刷或者自然脱落，增加归巢细胞量，并且低表达smad蛋白，避免移植MSCs存在的促纤维化风险。

Preparation and application of drug delivery system targeting mesenchymal stem cells

【技术实现步骤摘要】
靶向间充质干细胞药物递送系统的制备方法及其应用
本专利技术涉及药物递送领域，具体为靶向间充质干细胞药物递送系统的制备方法及其应用。
技术介绍
间充质干细胞是一种专能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。目前在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入.可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。由于它分化的组织类型十分广泛，因此临床应用价值不菲。充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞。MSCs最初在骨髓中发现，因其具有自我复制、多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控、异体移植不易发生免疫排斥等特点而日益受到人们的关注。如MSCs在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。因其处于未分化状态，增殖能力活跃，可以在体外大量培养、扩增，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。但MSCs移植治疗肝病仅处于理论阶段，在临床应用中仍存在许多亟待解决的问题。虽然大多数实验表明MSCs对组织损伤有修复作用，但疗效并不稳定，个体差异较大；更有研究显示MSCs移植对组织功能、组织结构的修复无作用，甚至有负面的影响。究其原因，一方面，移植的MSCs只有定植/归巢到病变部位，才能有效地发挥治疗和修复作用，但体内研究发现只有少量的移植细胞富集到了损伤或病变部位；其次，移植的MSCs定植到组织损伤部位，有的分化为组织巨噬细胞，而组织巨噬细胞对于组织星形细胞的活化、增殖、迁移、存活等有促进作用，不利于炎症和纤维化的修复。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供靶向间充质干细胞药物递送系统的制备方法及其应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：靶向间充质干细胞药物递送系统的制备方法及其应用，该方法包括以下步骤：S1：采集干细胞,采集间充质干细胞组织平铺接种于75cm2培养瓶，10％FBS+L-DMEM，37℃，饱和湿度下，5％CO2培养箱内进行培养；S2：检测细胞，取1代-5代传代细胞，制成单细胞悬液，以0.4％台盼蓝作为染色剂，用细胞计数板计数活细胞和死细胞，共3次，取3次平均值，计算细胞活率；S3：制作转染混合液，将miR-26b模拟物与转染试剂分别用L-DMEM稀释后混合，室温静置得到转染混合液；S4：间充质干细胞预处理，培养至第4代～8代、汇合度达80％～90％的间充质干细胞经PBS洗涤，再加入转染混合液；S5：培养细胞，在37℃培养箱中孵育5h～6h，接着把转染混合液更换为完全培养基，继续培养36h～48h；S6：碱性培养，转入miR-26b的间充质干细胞置入带有碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，处理0.5h～24h得到靶向间充质干细胞。优选的，所述步骤S4中，间充质干细胞来源于骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带、脐带血、羊水或者胎盘。优选的，所述步骤S2中，转染试剂将miR-26b转入间充质干细胞得到靶向间充质干细胞，且转染试剂为脂质体转染试剂。优选的，所述S5中，带有碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5ng/mL～20ng/mL。优选的，所述S4中，活细胞率(％)等于(未染色细胞数/观察细胞总数)×100％。活率在90％以上。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术中的间充质干细胞来源广泛，可以是自体的，也可以是异体的，来源充足，细胞的增殖、存活、分化、迁移、合成与分泌因子等各方面能力优良，无伦理问题、免疫原性低，应用前景广阔。本专利技术公开的组织损伤靶向间充质干细胞可以高效定植于组织损伤部位，避免血流冲刷或者自然脱落，增加归巢细胞量，并且低表达smad蛋白，避免移植MSCs存在的促纤维化风险，从而不仅有效发挥间充质干细胞修复组织损伤部位的组织结构与功能的作用，更降低了现有MSCs存在的促纤维化风险，真正实现移植间充质干细胞的组织损伤修复。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例一本专利技术提供一种技术方案：靶向间充质干细胞药物递送系统的制备方法及其应用，该方法包括以下步骤：S1：采集干细胞,采集间充质干细胞组织平铺接种于75cm2培养瓶，10％FBS+L-DMEM，37℃，饱和湿度下，5％CO2培养箱内进行培养；S2：检测细胞，取1代传代细胞，制成单细胞悬液，以0.4％台盼蓝作为染色剂，用细胞计数板计数活细胞和死细胞，共3次，取3次平均值，计算细胞活率；S3：制作转染混合液，将miR-26b模拟物与转染试剂分别用L-DMEM稀释后混合，室温静置得到转染混合液；S4：间充质干细胞预处理，培养至第4代、汇合度达80％的间充质干细胞经PBS洗涤，再加入转染混合液；S5：培养细胞，在37℃培养箱中孵育5h，接着把转染混合液更换为完全培养基，继续培养36h；S6：碱性培养，转入miR-26b的间充质干细胞置入带有碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，处理0.5h得到靶向间充质干细胞。其中，间充质干细胞来源于骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带、脐带血、羊水或者胎盘。转染试剂将miR-26b转入间充质干细胞得到靶向间充质干细胞，且转染试剂为脂质体转染试剂。带有碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5ng/mL。活细胞率(％)等于(未染色细胞数/观察细胞总数)×100％，活率在90％以上。实施例二本专利技术提供一种技术方案：靶向间充质干细胞药物递送系统的制备方法及其应用，该方法包括以下步骤：S1：采集干细胞,采集间充质干细胞组织平铺接种于75cm2培养瓶，10％FBS+L-DMEM，37℃，饱和湿度下，5％CO2培养箱内进行培养；S2：检测细胞，取3代传代细胞，制成单细胞悬液，以0.4％台盼蓝作为染色剂，用细胞计数板计数活细胞和死细胞，共3次，取3次平均值，计算细胞活率；S3：制作转染混合液，将miR-26b模拟物与转染试剂分别用L-DMEM稀释后混合，室温静置得到转染混合液；S4：间充质干细胞预处理，培养至第5代、汇合度达85％的间充质干细胞经PBS洗涤，再加入转染混合液；S5：培养细胞，在37℃培养箱中孵育5～6h，接着把转染混合液更换为完全培养基，继续培养12h；S6：碱性培养，转入miR-26b的间充质干细胞置入带有碱性成纤维细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.靶向间充质干细胞药物递送系统的制备方法及其应用，其特征在于，该方法包括以下步骤：/nS1：采集干细胞,采集间充质干细胞组织平铺接种于75cm2培养瓶，10％FBS+L-DMEM，37℃，饱和湿度下，5％CO2培养箱内进行培养；/nS2：检测细胞，取1代-5代传代细胞，制成单细胞悬液，以0.4％台盼蓝作为染色剂，用细胞计数板计数活细胞和死细胞，共3次，取3次平均值，计算细胞活率；/nS3：制作转染混合液，将miR-26b模拟物与转染试剂分别用L-DMEM稀释后混合，室温静置得到转染混合液；/nS4：间充质干细胞预处理，培养至第4代～8代、汇合度达80％～90％的间充质干细胞经PBS洗涤，再加入转染混合液；/nS5：培养细胞，在37℃培养箱中孵育5h～6h，接着把转染混合液更换为完全培养基，继续培养36h～48h；/nS6：碱性培养，转入miR-26b的间充质干细胞置入带有碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，处理0.5h～24h得到靶向间充质干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.靶向间充质干细胞药物递送系统的制备方法及其应用，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1：采集干细胞,采集间充质干细胞组织平铺接种于75cm2培养瓶，10％FBS+L-DMEM，37℃，饱和湿度下，5％CO2培养箱内进行培养；
S2：检测细胞，取1代-5代传代细胞，制成单细胞悬液，以0.4％台盼蓝作为染色剂，用细胞计数板计数活细胞和死细胞，共3次，取3次平均值，计算细胞活率；
S3：制作转染混合液，将miR-26b模拟物与转染试剂分别用L-DMEM稀释后混合，室温静置得到转染混合液；
S4：间充质干细胞预处理，培养至第4代～8代、汇合度达80％～90％的间充质干细胞经PBS洗涤，再加入转染混合液；
S5：培养细胞，在37℃培养箱中孵育5h～6h，接着把转染混合液更换为完全培养基，继续培养36h～48h；
S6：碱性培养，转入miR-26b的间充质干细胞置入带有碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，处理0.5h～...

【专利技术属性】
技术研发人员：段莉，王大平，徐晓，李兴福，熊建义，欧阳侃，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44