一种可稳定表达人RANK基因的工程细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种可稳定表达人RANK基因的工程细胞株及其应用，具体地，本发明专利技术提供一种工程细胞株，所述细胞株的基因组中整合有第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒表达外源的RANK基因，所述第二表达盒表达外源的受NF‑κB基因响应的报告基因。本发明专利技术的细胞株可用于体外测定或评估抗RANKL单抗对RANK‑RANKL之间相互作用的抑制或者阻断效果，本发明专利技术的方法具有专属性好、准确性高、精密度良好、检测范围宽、稳定耐用等特点。

An engineering cell line capable of stably expressing human rank gene and its application

【技术实现步骤摘要】
一种可稳定表达人RANK基因的工程细胞株及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种可稳定表达人RANK基因的工程细胞株及其及应用，更具体地，涉及可稳定表达人RANK基因的工程细胞株的构建方法，以及利用这一细胞株开发相应的生物分析方法，在生物制药中的应用。
技术介绍
生物学活性是生物药的关键质量属性，直接影响到生物药的质量，在整个工艺过程中需要严格把控。不同批次的原液、成品生物学活性存在一定差异，基于荧光素酶报告基因的MOA(ModeofAction)方法是一种简单、灵敏、操作简便的生活学活性测定方法，最能真实反映药物体内作用机理，同时能够准确的反映出生物药的活性差异。目前针对RANKL靶向治疗药物的生物学活性检测方法中，缺乏对检测体系专属性、准确性、精密度、线性、稳定性等方面的方法验证和评价，难以确保检测结果的准确性与可靠性。因此，本领域迫切需要开发一种可稳定表达人RANK基因的工程细胞株，可用于开发抗RANKL单抗药物的体外生物学活性细胞法，用于体外测定或评估抗RANKL单抗对RANK-RANKL之间相互作用的抑制或者阻断效果，方法稳定，重复性好。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可稳定表达人RANK基因的工程细胞株，可用于开发抗RANKL单抗药物的体外生物学活性细胞法，用于体外测定或评估抗RANKL单抗对RANK-RANKL之间相互作用的抑制或者阻断效果，方法稳定，重复性好。本专利技术的第一方面，提供了一种工程细胞株，所述细胞株为哺乳动物的体细胞，并且所述细胞株的基因组中整合有第一表达盒和第二表达盒，其中，所述第一表达盒表达外源的RANK基因，所述第二表达盒表达外源的受NF-κB基因响应的报告基因。在另一优选例中，所述的外源的RANK基因为人RANK基因。在另一优选例中，所述的RANK基因包括cDNA基因。在另一优选例中，所述的RANK基因包括野生型和突变型基因。在另一优选例中，所述报告基因的转录表达依赖NF-κB响应元件(NF-κBRE)的激活。在另一优选例中，所述的第二表达盒具有以下结构：(B1)n-B2-B3-B4(I)式中，B1为NF-κB响应元件(NF-κBRE)；n为3-10的正整数；B2为极小启动子元件(Minimalpromoterelement)；B3为报告基因编码序列；和B4为无或polyA序列；各“-”为键或连接序列。在另一优选例中，所述的n为4、5、6、7或8。在另一优选例中，所述的极小启动子元件为弱启动子。在另一优选例中，所述的极小启动子的长度为20-50nt，较佳地25-40nt。在另一优选例中，所述的极小启动子选自下组：源自adh启动子的极小启动子、源自HSVtk启动子的极小启动子。在另一优选例中，所述的(B1)n-B2的总长度≤150nt，较佳地≤125nt，更佳地≤120nt。在另一优选例中，各连接序列的长度为1-35nt。在另一优选例中，所述报告基因包括荧光素酶报告基因(Luciferase基因)。在另一优选例中，所述的报告基因为luc2P基因(Photinuspyralis)。在另一优选例中，所述的细胞株是人肾上皮细胞系。在另一优选例中，所述的细胞株是HEK293细胞或其衍生细胞。在另一优选例中，所述的细胞株是HEK293T细胞。在另一优选例中，所述工程细胞株的保藏号为CCTCCNO.C2017259。在另一优选例中，所述工程细胞株具有选自下组的一个或多个特性：(a)专属性好和特异性好，抗RANKL单抗与RANKL结合的拟合曲线呈现良好的“S”型趋势；(b)准确性好，比活性回收率在70-130％，较佳地，80-120％，更佳地，90-110％；(c)精密度好，比活性的RSD≤20％，较佳地，≤10％，更佳地，≤5％；(d)线性良好，线性系数R2＞0.95，较佳地，R2＞0.99；(e)测量范围广，在20-200％(较佳地50-150％)的比活性范围内均可准确测量(在该范围内生物活性曲线为线性)；(f)代次稳定性好；(g)本专利技术细胞株的不同代次细胞对应的IC50值为10-30ng/ml(指抗RANKL单抗药物对代次细胞的IC50)，较佳地，15-25ng/ml。本专利技术第二方面提供了一种试剂盒，包括本专利技术第一方面所述的工程细胞株。在另一优选例中，所述试剂盒还包括说明书。本专利技术第三方面提供了一种测定抗RANKL单抗药物生物活性的方法，包括步骤：(a)提供本专利技术第一方面所述的工程细胞株；(b)将待检测的抗RANKL单抗药物与所述工程细胞株孵育一段时间T1，并检测所述细胞株中的报告基因的活性，从而测定抗RANKL单抗药物生物活性。在另一优选例中，所述的步骤(b)包括：将待检测的抗RANKL单抗药物、RANKL蛋白和所述工程细胞株置于一反应体系中，并检测抗RANKL单抗对RANK－RANKL相应结合的抑制情况。在另一优选例中，在步骤(b)中，还包括基于所述的抑制情况获得抑制曲线，从而获得抗RANKL单抗药物的EC50值。在另一优选例中，所述报告基因包括荧光素酶报告基因(Luciferase基因)。在另一优选例中，所述活性包括酶活性。在另一优选例中，所述方法为体外检测方法。在另一优选例中，所述方法为非诊断性和非治疗性的方法。本专利技术第四方面提供了一种本专利技术第一方面所述的工程细胞株的用途，用于制备检测抗RANKL单抗药物生物活性的试剂或试剂盒。本专利技术第五方面提供了一种本专利技术第一方面所述的工程细胞株的构建方法，包括步骤：(1)提供第一载体和第二载体，其中，所述第一载体含有第一表达盒，所述第二载体含有第二表达盒，其中所述第一表达盒表达外源的RANK基因，所述第二表达盒表达外源的受NF-κB基因响应的报告基因；和(2)将所述第一载体和第二载体导入细胞中，经过筛选从而获得用于检测抗RANKL单抗药物生物活性的本专利技术第一方面所述的工程细胞株。在另一优选例中，所述第一载体、第二载体为同一载体或不同载体。在另一优选例中，所述的导入包括先后或同时导入。在另一优选例中，所述细胞包括人或非人哺乳动物细胞。在另一优选例中，所述的细胞株是人肾上皮细胞系。在另一优选例中，所述的细胞株是HEK293细胞或HEK293T细胞。在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述筛选包括抗性筛选、加压筛选。在另一优选例中，所述筛选包括第一阶段筛选和第二阶段筛选。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了HEK293T本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程细胞株,其特征在于，所述细胞株为哺乳动物的体细胞，并且所述细胞株的基因组中整合有第一表达盒和第二表达盒，其中，所述第一表达盒表达外源的RANK基因，所述第二表达盒表达外源的受NF-κB基因响应的报告基因。/n

【技术特征摘要】
20180724 CN 20181082097571.一种工程细胞株,其特征在于，所述细胞株为哺乳动物的体细胞，并且所述细胞株的基因组中整合有第一表达盒和第二表达盒，其中，所述第一表达盒表达外源的RANK基因，所述第二表达盒表达外源的受NF-κB基因响应的报告基因。


2.如权利要求1所述的工程细胞株，其特征在于，所述的外源的RANK基因为人RANK基因。


3.如权利要求1所述的工程细胞株，其特征在于，所述报告基因的转录表达依赖NF-κB响应元件(NF-κBRE)的激活。


4.如权利要求1所述的工程细胞株，其特征在于，所述的第二表达盒具有以下结构：
(B1)n-B2-B3-B4(I)
式中，
B1为NF-κB响应元件(NF-κBRE)；
n为3-10的正整数；
B2为极小启动子元件(Minimalpromoterelement)；
B3为报告基因编码序列；和
B4为无或polyA序列；
各“-”为键或连接序列。


5.如权利要求1所述的工程细胞株，其特征在于，所述报告基因包括荧光素酶报告基因(L...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡瑞，孙杨东，笪兴春，孙左宇，
申请(专利权)人：信达生物制药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32