用于ALS的突变型FUS模型制造技术

一种ALS模型，一种筛选用于治疗ALS的药物的方法以及一种构建ALS模型的方法，其中所述ALS模型表达突变型FUS，并且所述突变型FUS是FUS‑R521C。

A mutant Fus model for ALS

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于ALS的突变型FUS模型
本公开的实施方案总体上涉及生物医学，更具体地，涉及一种ALS模型，一种筛选用于治疗ALS的药物的方法以及一种构建ALS模型的方法。
技术介绍
新出现的证据表明，RNA代谢异常，包括RBP功能获得、RNA解旋酶功能丧失以及pre-mRNA剪接的错误加工，均会导致神经退行性疾病。其中，编码两个结构相似的RBP(TDP-43和FUS)的基因中的突变与ALS和FTD相关，这两个神经退行性疾病具有遗传和病理重叠。更引人注目的是，尽管其中许多不携带这两个RBP突变，但在大部分ALS和FTD中发现了泛素阳性且错误定位的TDP-43和FUS，这突显了RBP功能障碍在发病机理中的关键作用。然而，由这些RBP的功能障碍引起的神经退行性变疾病的疾病机理在很大程度上仍是未知的。近来，在众多其它RBP之中，包含低复杂性结构域(LCD)(也被称为内在无序区(IDR))的TDP-43和FUS均已在非翻译细胞质mRNA复合物(也被应激颗粒(SG))中被鉴定出来，该应激颗粒(SG)是这样的结构：其通常在应激条件下出现以暂时性停止胞质mRNA翻译的起始。与TDP-43和FUS一样，另一些RBP基因中的突变也与包括ALS和FTD在内的神经退行性疾病有关。在ALS和FTD患者标本中，错误定位的TDP-43与SG标志物共定位，而在培养细胞中，在应激诱导的SG中发现了过表达的突变型TDP-43和FUS。VCP(一种编码参与自噬清除SG的蛋白质的基因)中的突变也与ALS和FTD密切相关。综上所述，这些数据表明SG的错误加工可能是造成疾病的病因。然而，目前尚不清楚野生型和突变型RBP的内源水平在SG形成和相变中，特别是在面临应激攻击的疾病靶神经元中如何表现和起作用，部分原因是由于迫切需要合理的细胞和动物模型。过去，已经做出了巨大的努力来通过过量表达携带在ALS家族中发现的突变的重组DNA来产生ALS的动物模型。尽管这些转基因动物模型极大地加深了我们对疾病机理的了解，但人们可能会争辩说，在疾病模型中由突变蛋白的异位过量表达所驱动的潜在假象，如人类SOD1-G93A在小鼠中40倍过量表达，这是最受欢迎的ALS小鼠模型之一。类似的转基因策略已应用于生成TDP-43和FUSALS模型。但是，野生型TDP-43和FUS的过量表达也产生与许多动物物种(包括苍蝇、小鼠和大鼠)中的突变型转基因相似的运动表型，表明这些模型中发病机理的潜在假象。此外，转基因策略还有其它注意事项，包括不确定的基因组插入位点、不稳定的拷贝数、潜在的基因组完整性破坏、外源启动子驱动的异位表达模式以及缺乏内源的剪接调节。因此，需要做出巨大的努力来产生用于ALS的动物模型。
技术实现思路
本公开的实施方案寻求至少在某种程度上解决现有相关技术中存在的问题中的至少一个，或者为消费者提供有用的商业选择。本公开的第一广泛方面的实施方案提供一种ALS模型。根据一些实施方案，其中该ALS模型表达突变型FUS。本文所述的ALS模型具有确定基因组插入位点、稳定的拷贝数、基因组完整性、内源剪接调节，并且没有由外源启动子驱动的异位表达模式。该ALS模型可广泛用于ALS疾病机理研究和筛选用于治疗ALS的药物。根据一些实施方案，ALS模型可以进一步包括以下附加技术特征中的至少一个。根据一些实施方案，突变型FUS为FUS-R521C，其中FUS-R521的突变是人ALS中最常见的FUS突变。该ALS模型可更广泛地用于人ALS疾病机理研究和筛选用于治疗人ALS的药物。根据一些实施方案，ALS模型为动物、组织或细胞。根据本专利技术的具体实施方案，作为该ALS模型的动物、组织或细胞可广泛用于ALS疾病机理研究和筛选用于治疗ALS的药物。根据一些实施方案，组织或细胞分离自动物。根据本专利技术的具体实施方案，动物表达突变型FUS，分离自动物的组织或细胞也表达突变型FUS。作为该ALS模型的动物、分离自动物的组织或细胞可广泛用于ALS疾病机理研究和筛选用于治疗ALS的药物。根据一些实施方案，按如下获得细胞：将质粒引入受体细胞，其中所述质粒携带表达FUS-R521突变的核苷酸，其中所述受体细胞分离自人。如上所述获得的细胞可广泛用于ALS疾病机理研究和筛选用于治疗ALS的药物。根据一些实施方案，这些细胞是原代细胞或胚胎干细胞。根据本专利技术的具体实施方案，原代细胞和胚胎干细胞在应激处理下均具有ALS样的应激反应。原代细胞和胚胎干细胞均可广泛用于ALS的疾病机理研究和筛选用于治疗ALS的药物。根据一些实施方案，原代细胞为神经元细胞。肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种会导致控制自主肌肉的神经元死亡特定疾病。因此，神经元细胞的ALS样应激反应更为典型。根据一些实施方案，这些动物为C57BL/6J型小鼠。C57BL/6J小鼠品系背景已广泛用于生成小鼠疾病模型、疾病机理研究、药物安全性评估和药效评估。根据一些实施方案，按如下获得动物：将所述FUS-R521CKI突变型小鼠与C57BL/6J野生型小鼠回交至少5代。由于专利技术人用来生成FUS-R521CKI突变型小鼠ALS模型的Crispr/Cas9手段可能产生的脱靶效应，专利技术人将KI突变型品系回交到C57BL/6J野生型，以最大限度地避免Crispr/Cas9手段引入的潜在脱靶。五代回交将驱动约KI突变型小鼠97％的基因组至C57BL/6J野生型背景。根据一些实施方案，按如下获得动物：将FUS-R521CKI突变型小鼠回交至C57BL/6J野生型小鼠10代。由于专利技术人用来生成FUS-R521CKI突变型小鼠ALS模型的Crispr/Cas9手段可能产生的脱靶效应，专利技术人将KI突变型品系回交到C57BL/6J野生型，以最大限度地避免Crispr/Cas9手段引入的潜在脱靶。十代回交将驱动约KI突变型小鼠99.9％的基因组至C57BL/6J野生型背景。本公开的第二广泛方面的实施方案提供了一种筛选用于治疗ALS的药物的方法。根据一些实施方案，该方法包括：应激处理上述ALS模型；以及使候选试剂与经过应激处理的ALS模型接触；基于接触前后ALS模型的变化，判断候选试剂为治疗ALS的药物。根据本专利技术实施方案的方法，可以有效地筛选出用于治疗ALS的药物。根据一些实施方案，该方法可以进一步包括以下附加技术特征中的至少一者。根据一些实施方案，应激处理包括氧化应激、内质网应激和线粒体应激中的至少一种。更具体地，氧化应激反映了反应性氧物质的全身表现与生物系统易于对活性中间体进行解毒或修复所造成的损伤的能力之间的不平衡。细胞正常氧化还原状态的紊乱可通过产生过氧化物和自由基而引起毒性作用，这些过氧化物和自由基会破坏细胞的所有成分，包括蛋白质、脂质和DNA。内质网应激响应于内质网腔中未折叠或错误折叠的蛋白质的积累而被激活。线粒体应激是导致线粒体功能障碍的情况(遗传、环境因素、衰老)，包括由于线粒体来源的ROS产生增加引起的氧化应激、细胞能量代谢下降以及凋亡反应中断，都是导致观察到的基于线粒体疾病的一些本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ALS模型，其中所述ALS模型表达突变型FUS。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种ALS模型，其中所述ALS模型表达突变型FUS。


2.根据权利要求1所述的ALS模型，其中所述突变型FUS是FUS-R521C，其中所述FUS-R521处的突变是人ALS中最频繁的FUS突变。


3.根据权利要求1所述的ALS模型，其中所述ALS模型是动物、组织或细胞。


4.根据权利要求3所述的ALS模型，其中所述组织或细胞分离自所述动物。


5.根据权利要求3所述的ALS模型，其中细胞按如下获得：
将质粒引入受体细胞，其中所述质粒携带表达FUS-R521突变的核苷酸，其中所述受体细胞分离自人。


6.根据权利要求3所述的ALS模型,其中所述细胞是原代细胞或胚胎干细胞。


7.根据权利要求6所述的ALS模型，其中所述原代细胞是神经元细胞。


8.根据权利要求3或4所述的ALS模型，其中所述动物是C57BL/6J型小鼠。


9.根据权利要求8所述的ALS模型，其中所述动物按如下获得：
将所述FUS-R521CKI突变型小鼠与C57BL/6J野生型小鼠回交至少5代。


10.根据权利要求9所述的ALS模型，其中所述动物按如下获得：
将所述FUS-R521CKI突变型小鼠与C57BL/6J野生型小鼠回交10代。


11.一种筛选用于治疗ALS的药物的方法，所述方法包括：
对根据权利要求1至10中任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雪，贾怡昌，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11