MPLA和IFN-γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种MPLA和IFN

【技术实现步骤摘要】
MPLA和IFN
‑
γ
组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法


[0001]本专利技术属于细胞工程领域，具体地说，涉及一种MPLA和IFN
‑
γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法。

技术介绍

[0002]嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR
‑
Mac）疗法已经成为细胞免疫治疗领域的一个重要的方向。该疗法是将从外周血来源的CD14阳性单核细胞诱导成巨噬细胞，并通过病毒的形式将外源基因导入巨噬细胞，生产CAR
‑
Mac。
[0003]目前，通过病毒转染方式生产嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR
‑
Mac）主要有两种方式：慢病毒和腺病毒，这两种方式虽然都有一定的转染效率，但是由于巨噬细胞的特性，转染效率在20%以下。有部分研究人员通过改造腺病毒（Ad5F35腺病毒）感染巨噬细胞，虽然提高了腺病毒转染巨噬细胞的效率，在较高的MOI情况下，转染效率可以达到50%左右，但是该种方法需要使用大量腺病毒，使得嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR
‑
Mac）成本较高，同时CAR
‑
Mac细胞的得率较低，状态差。虽然有其他研究人员也试图通过改造慢病毒，使用LV
‑
Vpx慢病毒转染巨噬细胞，但是转染效率依然不高；并且，慢病毒转染有随机整合的风险，存在造成巨噬细胞基因突变的风险。
[0004]申请人申请了中国专利CN202211148544.3，专利技术名称为：一种提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，该专利公开了：LPS和IFN
‑
γ联合使用可以提高Ad5F35腺病毒感染巨噬细胞的效率，使得在合理的MOI情况下，转染效率得到提高。但是申请人在后续研究发现一个技术问题：因Ad5F35腺病毒成本较高，如何能进一步降低Ad5F35腺病毒使用量，同时仍然保持较高转染效率，如果能解决该技术问题则将进一步推广腺病毒转染巨噬细胞在市场上的应用。
[0005]单磷酸脂质A（monophosphoryl lipid A，MPLA）一般用于在疫苗制剂中，作为免疫佐剂可以促使其诱导高质量且持久的免疫应答。目前，MPLA并没有应用于腺病毒转染巨噬细胞的相关报道。
[0006]本专利技术开发了一种将单磷酸脂A（MPLA）或其类似物应用于巨噬细胞激活极化及腺病毒感染巨噬细胞方法中，可以降低腺病毒使用量，提高转染效率。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的是提供一种MPLA和IFN
‑
γ组合使用可以提高Ad5F35腺病毒感染巨噬细胞的效率的方法，该方法中Ad5F35腺病毒使用量更少，同时可以大大提高转染效率，而且可以提高细胞的得率和状态，使得嵌合抗原受体巨噬细胞（CAR
‑
Mac）产品更加安全有效，产品质量更高，产量更高。
[0008]第一方面，本专利技术公开了一种MPLA和IFN
‑
γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，包括如下步骤：
[0009]S1、巨噬细胞激活和极化：将外周血单核细胞PBMC分化为巨噬细胞；向巨噬细胞中
添加25
‑
100ng/ml IFN
‑
γ和25
‑
200ng/ml MPLA或MPLA类似物,激活极化巨噬细胞6
‑
48h；
[0010]S2、腺病毒转染巨噬细胞：向激活极化后的巨噬细胞中按照100
‑
500 MOI加入腺病毒，转染24
‑
172h，转染目的基因；转染目的基因后，可以换液，继续培养细胞一段时间。
[0011]步骤S3、转染后基因表达检测：将将步骤S2中获得的腺病毒转染后的巨噬细胞，消化处理，200
‑
500g离心2
‑
10min，收集细胞，用流式检测目的基因的表达CAR:嵌合抗原受体。
[0012]进一步的技术方案，所述步骤S1中，外周血单核细胞PBMC分化为巨噬细胞的具体方法为：将PBMC复苏后通过CD14磁珠进行阳性分选出单核细胞，放入培养皿，添加25
‑
100ng/ml GM
‑
CSF促进单核细胞分化为巨噬细胞，达到规定的细胞接种密度后，将其放入CO2培养箱，培养24
‑
72h。
[0013]进一步的技术方案，所述细胞接种密度为0.5
×
106～4
×
106个/mL；所述CO2培养箱的温度为35～38℃,CO2浓度为3～7％。
[0014]进一步的技术方案，所述的IFN
‑
γ的浓度为40
‑
60ng/ml ，优选50ng/ml ；MPLA或MPLA类似物的浓度为50
‑
150ng/ml，优选75ng/ml。
[0015]进一步的技术方案，所述步骤S1中，激活活化后的巨噬细胞为M1型巨噬细胞；
[0016]所述的MPLA类似物包括吡喃葡萄糖基脂C529（CAS No. 216014
‑
46
‑
9）、OM
‑
174（CAS No.171092
‑
39
‑
0）、E6020（CAS No.287180
‑
63
‑
6）、ONO
‑
4007（CAS No.152646
‑
95
‑
2）、GLA（CAS No.1246298
‑
63
‑
4）等。
[0017]进一步的技术方案，所述的腺病毒为Ad5F35腺病毒。
[0018]第二方面，本专利技术公开了一种激活和极化巨噬细胞的组合物，包括25
‑
100ng/ml IFN
‑
γ和25
‑
200ng/ml MPLA或MPLA类似物。
[0019]进一步的技术方案，所述的 IFN
‑
γ的浓度为40
‑
60ng/ml ，优选50ng/ml ；MPLA或MPLA类似物的浓度为50
‑
150ng/ml，优选75ng/ml。
[0020]进一步的技术方案，所述的MPLA类似物包括吡喃葡萄糖基脂C529（CAS No. 216014
‑
46
‑
9）、OM
‑
174（CAS No.171092
‑
39
‑
0）、E6020（CAS No.287180
‑
63
‑
6）、ONO
‑
4007（CAS No.152646
‑
95
‑
2）、GLA（CAS No.1246298
‑
63
‑
4）等。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.MPLA和IFN
‑
γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、巨噬细胞激活和极化：将外周血单核细胞PBMC分化为巨噬细胞；向巨噬细胞中添加25
‑
100ng/ml IFN
‑
γ和25
‑
200ng/ml MPLA或MPLA类似物,激活极化巨噬细胞6
‑
48h；S2、腺病毒转染巨噬细胞：向激活极化后的巨噬细胞中按照100
‑
500 MOI加入腺病毒，转染24
‑
172h，转染目的基因。2.根据权利要求1所述的MPLA和IFN
‑
γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于：所述步骤S1中，外周血单核细胞PBMC分化为巨噬细胞的具体方法为：将PBMC复苏后通过CD14磁珠进行阳性分选出单核细胞，放入培养皿，添加25
‑
100ng/ml GM
‑
CSF促进单核细胞分化为巨噬细胞，达到规定的细胞接种密度后，将其放入CO2培养箱，培养24
‑
72h。3.根据权利要求2所述的MPLA和IFN
‑
γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于：所述细胞接种密度为0.5
×
106～4
×
106个/mL；所述CO2培养箱的温度为35～38℃,CO2浓度为3～7％。4.根据权利要求1所述的MPLA和IFN
‑
γ组合使用提高腺病毒转染巨噬细胞效率的方法，其特征在于：所述的IFN
‑
γ的浓度为40
‑
60ng/ml ，优选50ng/ml ；MPLA或MPLA类似物的浓度为50
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：王浩，童建松，权召，张厉，严少华，马锐，
申请(专利权)人：赛元生物科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：