一种降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体及其构建方法技术

本发明专利技术属生物工程技术领域，为降低重组腺病毒与宿主细胞发生同源重组的概率，提供了一种降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体及其构建方法。通过敲除人5型腺病毒的E1B区基因，且敲除至第4090碱基处，将5型腺病毒和HEK293基因组DNA之间的同源序列长度缩短至254bp，被删除的E1区基因片段中包括编码p

【技术实现步骤摘要】
一种降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体及其构建方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体及其构建方法。

技术介绍

[0002]基因治疗是将外源正常基因或者具有治疗效果的基因通过一定的方式导入至人体靶细胞中，以纠正或补偿缺陷和异常基因，达到治疗的目的。近些年来重组腺病毒载体在基因治疗方面发挥了巨大的作用。重组腺病毒载体具有可以在培养中重组，较高的转基因插入能力等特点，在恶性肿瘤、中枢神经系统疾病、遗传病等都有重要应用。
[0003]虽然重组腺病毒载体有着广泛应用，但是也存在潜在的危险性。在重组腺病毒的生产过程中，重组腺病毒有概率会与宿主细胞发生同源重组，即发生回复突变(RCA)。回复突变不但会导致外源正常基因或者具有治疗效果的基因丢失，而且会产生具有复制能力的腺病毒，会对人体产生潜在的副作用。各国监管部门对使用重组腺病毒载体的基因治疗药物的回复突变的比例提出了非常高的要求，如美国食品药品监督管理局(FDA)要求在3
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1010个拷贝的腺病毒颗粒中不超过1个拷贝的回本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体，其特征在于：所述降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体由如下方法制备得到：通过敲除人5型腺病毒的E1B区基因，且敲除至第4090碱基处，将5型腺病毒和HEK293基因组DNA之间的同源序列长度缩短至254bp，被删除的E1区基因片段中包括编码p
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的序列Ad5 3551
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4070；然后将编码pIX的序列Ad5 3551
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4070反向插入在E4区，即Ad5 35771处。2.制备权利要求1所述的降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)构建左侧质粒：保留左侧端末端重复序列(ITR)和E1A区，删除E1B区，包括编码pIX的序列，在原本E1B区位置插入外源基因，保留5型腺病毒4091
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5196序列；(2)构建右侧质粒：保留除了E3区的其余腺病毒基因组，保留E3区中编码腺病毒死亡蛋白ADP的序列，在E4区反向插入编码pIX的序列；(3)病毒包装：左侧质粒和右侧质粒分别使用限制性内切酶Pac I进行线性化，37℃酶切30
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60min；后续65℃孵育30
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60min使限制性内切酶Pac I失活；用PEI转染试剂使线性化的质粒在HEK293细胞聚合度为80％
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90％时进行共转染，转染后10
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14天HEK293细胞出现病变效应，超过50％细胞从培养瓶底部脱落；此时收集细胞悬液，冻融三次后3000rpm离心5
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10min收集上清，得到重组病毒悬液。3.根据权利要求2所述的制备降低回复突变频率的重组5型腺病毒载体的方法，其特征在于：步骤(1)中构建左侧质粒的具体方法为：以pfg140为模板扩增Ad5 1
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1668片段，以pBHG10为模板扩增Ad5 4091
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5196片段，中间插入CMV
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hGM
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CSF
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【专利技术属性】
技术研发人员：梁旻，
申请(专利权)人：上海锦斯湲创生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：