增加共转染mRNA的蛋白表达水平和表达时长的重组基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一类增加共转染mRNA的蛋白表达水平和表达时长的重组基因，属于mRNA基因工程技术；所述重组基因编码的多肽为具有核糖核酸酶Ⅲ活性、不受核糖核酸酶抑制剂抑制并且不降解单链RNA的多肽；所述重组基因和目标基因可以串联或平行构建，形成融合蛋白或独立表达的重组蛋白；或以2A肽、内部核糖体进入位点等进行隔离，表达出独立的重组增强蛋白及目标蛋白；重组增强蛋白通过降解dsRNA、tRNA、miRNA及其前体分子，抑制宿主细胞先天免疫机制和mRNA降解机制，使共转染基因的蛋白表达水平提高3

【技术实现步骤摘要】
增加共转染mRNA的蛋白表达水平和表达时长的重组基因及其应用


[0001]本专利技术涉及mRNA基因工程技术，尤其涉及一类加共转染mRNA的蛋白表达水平和表达时长的重组基因及其应用。

技术介绍

[0002]真核信使RNA(mRNA)是由几个不同元素组成的单链核糖核酸分子，包括一个5
’‑
m7G 帽、一个5
’‑
非翻译区(5
’
UTR)、一个翻译起始密码子、一个编码区、终止密码子、一个3
’
UTR和聚腺苷酸(poly
‑
A)尾巴。这些元件用作蛋白质序列翻译的模板和调控。mRNA蛋白的翻译效率受mRNA各成分的影响，并与宿主细胞类型有关。mRNA介导的基因治疗取决于递送基因的蛋白质翻译效率以及蛋白质的药效学和毒理学特征。药用mRNA的重组序列必须根据宿主细胞类型进行优化。而mRNA药物制备中面临的挑战是避免mRNA和递送材料的免疫原性，以及热源杂质，同时提高mRNA细胞内稳定性、蛋白质翻译效率和蛋白质表达动力学特性。脂质原辅料及其降解产物的免疫原性，以及mRNA的自身免疫原性，可以激发细胞先天免疫机制，引起机体的炎症反应和细胞免疫反应。这与细胞内mRNA降解机制相结合，导致mRNA胞内稳定性降低。因此，mRNA基因治疗药物开发，除了需要优化设计mRNA序列外，也需要规避宿主细胞先天免疫机制和mRNA降解机制的影响。
[0003]目前针对细胞内mRNA降解机制的技术解决方案涉及mRNA重组序列优化，例如编码优化、poly/>‑
A延伸、UTR优化和miRNA靶序列去除等方法，以及先天免疫抑制剂。对于递送脂质，开发出来了具有低免疫原性的可电离脂质和辅助脂质。为了解决mRNA的自身免疫原性，核苷修饰技术，主要是假尿嘧啶修饰，被用来减少mRNA对宿主细胞先天免疫反应的激活。这些方法是目前提高基于mRNA疗法的稳定性和功效的主流技术途径。尤其是辉瑞/BioNTech、和Moderna使用甲基假尿嘧啶核苷修饰技术成功开发新冠病毒mRNA疫苗的经验，和CureVac等利用天然非修饰mRNA开发疫苗的失败教训，确立了核苷修饰技术在mRNA疫苗研发中的关键作用。经核苷修饰的mRNA不仅仅提升蛋白表达水平，更重要的是避免激活细胞先天免疫机制的作用，产生更为专一的结合抗体和中和抗体。
[0004]但是，目前应用的技术手段只能从制剂生产的角度，尽可能的消除免疫原，部分缓解先天免疫机制和mRNA降解机制对mRNA稳定性造成的影响。受到认知水平、核苷修饰复杂性、生产工艺难度、及储存条件等因素的限制，改进效果受到很大制约。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一，就在于提供一类增加共转染mRNA的蛋白表达水平和表达时长的重组基因，以解决上述问题。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是这样的：增加共转染mRNA的蛋白表达水平和表达时长的重组基因，所述重组基因编码的多肽为具有核糖核酸酶Ⅲ活性、不受核糖核酸酶抑制剂抑制并且不降解单链RNA的多肽。
[0007]作为优选的：所述多肽为重组豹蛙酶或缺失、取代、插入或增加一个或多个氨基酸的豹蛙酶重组衍生物；或其人类对应基因的重组衍生物。
[0008]作为进一步优选的：所述豹蛙酶重组衍生物为在豹蛙酶的N
‑
端用氨基酸Met和Ser取代Gln，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述其人类对应基因的重组衍生物具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，分别为rAng (RNase 5)和rRanpK32R。
[0009]作为优选的：所述多肽为重组Amphinase或缺失、取代、插入或增加一个或多个氨基酸的Amphinase重组衍生物。
[0010]作为进一步优选的：所述Amphinase重组衍生物为具有如SEQ ID NO.3
‑
7所示的氨基酸序列，依次为：rAmph1 (基于Amph
‑
1 P85072)、rAmph2 (基于Amph
‑
2 P85073)、rAmph3 (基于Amph
‑
3 P85074)、rAmph4 (基于Amph
‑
4 P85075)和rBS
‑
RNase。
[0011]本专利技术的目的之二，在于提供一种利用上述的重组基因外源目标RNA在机体中表达水平的方法，采用的技术方案为：所述增强基因和目标基因以串联方式构建于同一mRNA表达框架下，形成融合蛋白；或以2A肽、内部核糖体进入位点进行隔离，表达出独立的重组增强蛋白及目标蛋白；或独立构建于mRNA表达框架，与目标基因mRNA混合制备，实施共转染。
[0012]作为优选的：所述增强基因的核苷酸序列添加到任意在真核表达的RNA载体中，以独立转染或共转染的方式进行蛋白表达，提高外源目的基因在机体和细胞中的表达水平。
[0013]作为优选的：所述重组基因的引入与核苷修饰相结合。本专利技术的重组增强基因与核苷修饰技术相结合，能够对于mRNA表达增强有协同增效的效果。
[0014]本专利技术的又一个目的，在于提供上述方法制得的mRNA制剂。
[0015]作为优选的：所述制剂为注射剂。
[0016]本专利技术的再一个目的，在于提供上述的mRNA制剂在制备生物疫苗及基因药物中的应用。
[0017]本申请的专利技术人通过大量试验发现，通过抑制宿主细胞先天免疫反应机制和mRNA降解机制的方法来增加蛋白翻译效率，可以在更大维度上降低细胞对脂质、mRNA及其水解物杂质的先天免疫反应性，取代核苷修饰，或与现有的核苷修饰技术结合以产生协同效应，从而更大地提高蛋白表达效率。
[0018]核酸酶Ⅲ(RN3, RNase
ꢀⅢ
)是一种原核生物的核糖核酸酶，降解双链RNA（dsRNA）。Dicer和Drosha是人RN3型核酸酶，切割miRNA前体而参与miRNA的成熟转化，并进一步参与基因转译水平和mRNA稳定性的调控。
[0019]具体而言：mRNA疫苗制剂中含有的免疫原性物质，包括：LNP（脂质纳米颗粒）是一种复合物制剂，其组成成分被认为是无药效活性并且毒性较小，但所用组份，如PEG、可电离脂质具有弱免疫原性。杂质及保存过程中脂质成分的氧化降解产物均有可能刺激免疫反应。这些物质刺激产生非特异免疫反应，导致副反应。下面是对主要免疫原成份及其对mRNA表达效率影响分析：mRNA：真核细胞合成的天然mRNA经过转录后修饰，拥有大量修饰核苷，包括假脲嘧啶和甲基化腺苷，没有免疫原性。体外转录（IVT）合成的未修饰mRNA分子是一种免疫模式受体 (TLRs，及RIG
‑
1) 的激活分子，在细胞中能够激活细胞内TLR和RIG
‑
I受体，激活细胞先天免疫反应，并诱发炎症反应，导致翻译抑制和mRNA降解。体外合成中用N1
‑
甲基假尿苷
(Ψ)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.增加共转染mRNA的蛋白表达水平和表达时长的重组基因，其特征在于：所述重组基因编码的多肽为具有核糖核酸酶Ⅲ活性、不受核糖核酸酶抑制剂抑制并且不降解单链RNA的多肽。2.根据权利要求1所述的增加共转染mRNA的蛋白表达水平和表达时长的重组基因，其特征在于：所述多肽为重组豹蛙酶或缺失、取代、插入或增加一个或多个氨基酸的豹蛙酶重组衍生物；或其人类对应基因的重组衍生物。3.根据权利要求2所述的增加共转染mRNA的蛋白表达水平和表达时长的重组基因，其特征在于：所述豹蛙酶重组衍生物为在豹蛙酶的N
‑
端依次用氨基酸Met和Ser取代Gln，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述其人类对应基因的重组衍生物具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的增加共转染mRNA的蛋白表达水平和表达时长的重组基因，其特征在于：所述多肽为重组Amphinase或缺失、取代、插入或增加一个或多个氨基酸的Amphinase重组衍生物。5. 根据权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐凯，吴秀锦，雷颖雪，陈亮，张耀艺，杨建，刁泠丹，
申请(专利权)人：成都诺恩基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：