CRISPR/SprCas9基因编辑系统的开发及应用技术方案

本文提供了Cas9蛋白突变体，该Cas9蛋白突变体的PAM识别结构域识别的PAM序列为NNGG。本文还提供了与该Cas9蛋白突变体配合使用的sgRNA骨架序列以及它们在CRISPR/Cas9基因编辑技术中的应用。辑技术中的应用。辑技术中的应用。

【技术实现步骤摘要】
CRISPR/SprCas9基因编辑系统的开发及应用


[0001]本文涉及SprCas9蛋白突变体，尤其是改进了PAM识别序列的SprCas9蛋白突变体。本文还涉及该SprCas9蛋白突变体在基因编辑方面的应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9系统是目前科研及临床研究方面应用最广泛的基因编辑工具，具有高效、特异及设计简便等优势。已有多种Cas9蛋白被发现，其中研究最多应用最广泛的为Streptococcus pyogenes(SpCas9)和Staphylococcus aureus(SaCas9)，不过SpCas9体积较大(约1368个氨基酸)，达到了AAV载体的包装上限，严重限制了其在临床治疗方面的应用，SaCas9体积较小(约1052个氨基酸)，具有广阔的临床应用前景，然而SaCas9的PAM序列较长，编辑范围受限。因此，鉴定体积小、活性高、编辑范围广的新型Cas9蛋白对CRISPR/Cas9基因编辑工具的临床转化意义重大。

技术实现思路

[0003]在一方面，本文提供了Cas9蛋白突变体，其中所述Cas9蛋白突变体的PAM识别结构域识别的PAM序列为NNGG，所述Cas9蛋白选自SprCas9、SdeCas9以及SwaCas9。
[0004]在一些实施方案中，所述Cas9蛋白突变体的PAM识别结构域包括来自SlugCas9蛋白的PAM识别结构域的氨基酸序列。
[0005]在一些实施方案中，所述来自SlugCas9蛋白的PAM识别结构域的氨基酸序列为SDTRNM(SEQ ID NO：1)。
[0006]在一些实施方案中，所述Cas9蛋白为SprCas9，并且所述Cas9蛋白突变体相对于所述SprCas9在氨基酸序列上的差异至少包括所述Cas9蛋白突变体中所述PAM识别结构域中的氨基酸序列SDKRNL(SEQ ID NO：2)被替换为SDTRNM(SEQ ID NO：1)。
[0007]在一些实施方案中，所述Cas9蛋白突变体包括SEQ ID NO：3所示氨基酸序列。
[0008]在一些实施方案中，所述Cas9蛋白突变体还包括突变R247A、N415A和R656A。
[0009]在一些实施方案中，所述Cas9蛋白突变体还包括突变S421A。
[0010]另一方面，本文提供了sgRNA，其骨架序列包括SEQ ID NO：26或27所示序列。
[0011]在一方面，本文提供了CRISPR/Cas9基因编辑系统，包括上述Cas9蛋白突变体。
[0012]在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统还包括上述sgRNA。
[0013]另一方面，本文提供了试剂盒，其包括上述Cas9蛋白突变体和/或sgRNA。
[0014]本文提供的Cas9蛋白突变体相对较小，PAM序列较短，编辑范围广泛，并具有较高的编辑活性和特异性。
附图说明
[0015]图1新型Cas9蛋白的鉴定和活性评估结果。
[0016](A)SaCas9同源蛋白PAM识别结构域序列比对，红框圈出部分是决定PAM序列的关
键氨基酸，后续活性评估中将SprCas9、SdeCas9、SwaCas9此处氨基酸替换为SlugCas9对应的氨基酸序列(SlugCas9的PAM序列为NNGG)，如SprCas9突变为SprCas9(NNGG)；(B)HEK293T
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GFP
‑
Puro reporter细胞系中评估不同新型Cas9的活性，设计靶向GFP的gRNA，通过FACS检测GFP的敲低情况；(C)HEK293T
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GFP
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Puro reporter细胞系中GFP敲低结果统计，SprCas9(NNGG)表现出显著高于SlugCas9的编辑活性。
[0017]图2SprCas9(NNGG)PAM序列鉴定结果。
[0018](A)sgRNA靶向位点3
’
端插入6bp NNNNNN的GFP部分序列示意图，此GFP序列通过慢病毒侵染HEK293T细胞，构建稳转单克隆细胞系；(B)SprCas9(NNGG)对图A稳转细胞系编辑情况示意，蓝框标出的reads在酶切位点处插入一个碱基A，作为可信编辑用作PAM序列鉴定；(C)未转染SprCas9(NNGG)的序列分布情况，作为负对照，确定可信编辑；(D)通过生信分析，鉴定出SprCas9(NNGG)的PAM序列为NNGG。
[0019]图3SprCas9(NNGG)和SaCas9对细胞内源位点编辑效率比较结果。
[0020](A)不同细胞内源位点处SprCas9(NNGG)和SaCas9造成的Indel比例；(B)所有内源位点处SprCas9(NNGG)的编辑效率比上SaCas9的编辑效率，显示SprCas9(NNGG)整体具有更高的编辑活性。
[0021]图4SprCas9(NNGG)和SaCas9特异性比较结果。
[0022](A)sgRNA发生1bp颠换时SprCas9(NNGG)和SaCas9的Indel比例；(B)sgRNA发生2bp颠换时SprCas9(NNGG)和SaCas9的Indel比例。
[0023]图5Spr
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sgRNA鉴定。
[0024](A)Spr
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sgRNAL(long scaffold)及Spr
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sgRNAS(short scaffold)序列及二级结构预测；(B)靶向GFP基因上两个locus，通过FACS比较Sa
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sgRNA、Spr
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sgRNAL及Spr
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sgRNAS共转SprCas9(NNGG)对GFP KO情况示意图；(C)对GFP KO效率进行统计，每个样品两个重复rep1和rep2。
具体实施方式
[0025]除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
[0026]术语“或”是指列举的可选择要素中的单个要素，除非上下文明确地另外指出。术语“和/或”是指所列举的可选择要素中的任意一个、任意两个、任意三个、任意更多个或其全部。
[0027]术语“包含”或“包括”指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。当使用“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及某组合或组合物“包括A和B”时，也旨在涵盖由A和B组成的组合或组合物。
[0028]在提及具体数值时，除非上下文另有说明或暗示，通常可认为同时提及所列数值的
±
10％范围内的任何数值。
[0029]“CRISPR基因编辑技术”是一种由RNA指导的通过Cas核酸酶对靶基因进行DNA编辑的技术。该技术所使用的CRISPR基因编辑系统包括Cas核酸酶和引导RNA(single...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Cas9蛋白突变体，其中所述Cas9蛋白突变体的PAM识别结构域识别的PAM序列为NNGG，所述Cas9蛋白选自SprCas9、SdeCas9以及SwaCas9。2.如权利要求1所述的Cas9蛋白突变体，其中所述Cas9蛋白突变体的PAM识别结构域包括来自SlugCas9蛋白的PAM识别结构域的氨基酸序列。3.如权利要求2所述的Cas9蛋白突变体，其中所述来自SlugCas9蛋白的PAM识别结构域的氨基酸序列为SDTRNM(SEQ ID NO：1)。4.如权利要求1
‑
3任一项所述的Cas9蛋白突变体，其中所述Cas9蛋白为SprCas9，并且所述Cas9蛋白突变体相对于所述SprCas9在氨基酸序列上的差异至少包括所述Cas9蛋白突变体中所述PAM识别结构域中的氨基酸序列SDKRNL(SEQ ID NO：2)被替换为SDTRNM(SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：王成，刘璐璐，张丽明，
申请(专利权)人：北京因诺惟康医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：