一种用于培育抗TGEV感染的猪品种的成套系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种用于培育抗猪传染性胃肠炎病毒感染的猪品种的成套系统及其应用。所述系统包括基因编辑蛋白、pAPN

【技术实现步骤摘要】
一种用于培育抗TGEV感染的猪品种的成套系统及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于培育抗TGEV感染的猪品种的成套系统及其应用。

技术介绍

[0002]猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis，TGE)是一种高度接触传染性疾病，该病病原为猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)，主要引起猪腹泻、呕吐、脱水和死亡，其中初生仔猪中死亡率高达100％。因此TGE被认为是危害养猪产业的重要传染病之一。目前对于TGE仍没有有效的控制手段和治疗方法，虽然接种疫苗可以在一定程度上缓解疫情的扩大蔓延，但是常规TGE疫苗也存在着缺陷。随着生物技术的不断发展，利用基因编辑技术培育抗病毒性腹泻猪新品种是生猪绿色健康养殖的产业需求。
[0003]TGEV入侵宿主细胞通过病毒的S蛋白与宿主细胞膜上的特异性受体蛋白分子相互结合来实现。就TGEV本身而言，致病性的差异往往是多种因素导致的，既有可能是单一基因片段的一个或多个氨基酸差异导致的，也有可能是多个基因片段的协同作用。已有研究发现pAPN蛋白是TGEV进入细胞的关键受体，但是关于该蛋白发挥作用的是哪些(或哪个)关键氨基酸位点未见报道。因此探讨决定TGEV致病性的pAPN关键氨基酸位点，并利用基因编辑技术创制关键氨基酸位点精确突变的基因编辑猪，以期为培育能够抵抗TGEV感染的猪新品种奠定材料基础，对于生猪产业具有重要的科学和实际意义。

技术实现思路

>[0004]本专利技术要解决的技术问题是如何培育能够抵抗TGEV感染的猪品种。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种成套系统。
[0006]本专利技术提供的成套系统包括基因编辑蛋白、pAPN
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sgRNA
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1、pAPN
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sgRNA
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2和供体DNA；
[0007]所述pAPN
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sgRNA
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1和所述pAPN
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sgRNA
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2分别靶向pAPN基因的两个不同的靶序列，将所述pAPN
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sgRNA
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1的靶序列与所述pAPN
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sgRNA
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2的靶序列之间的片段记作待定点修饰片段(所述待定点修饰片段不包含所述pAPN
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sgRNA
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1的靶序列与所述pAPN
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sgRNA
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2的靶序列)；所述待定点修饰片段含有编码猪pAPN蛋白第737位色氨酸的密码子；所述供体DNA含有定点修饰片段，所述定点修饰片段为将所述待定点修饰片段中编码猪pAPN蛋白第737位色基酸密码子突变为丙氨酸的密码子后得到的片段。
[0008]上述成套系统中，所述基因编辑蛋白具体可为Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2，优选为Cas9蛋白。
[0009]上述成套系统中，所述供体DNA依次包括上游同源臂序列(所述上游同源臂序列包含所述pAPN
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sgRNA
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1的靶序列)、所述定点修饰片段和下游同源臂序列(所述下游同源臂序列包含所述pAPN
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sgRNA
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2的靶序列)；所述上游同源臂序列为自所述待定点修饰片段中的
第一个核苷酸对应的位点起向其上游方向(此处上游方向是相对于猪基因组序列而言)延伸得到的任意一个DNA片段(该片段不包含待定点修饰片段中的第一个核苷酸)；
[0010]所述下游同源臂为自所述待定点修饰片段中的最后一个核苷酸对应的位点起向其下游方向(此处下游方向是相对于猪基因组序列而言)延伸得到的任意一个DNA片段(该片段不包含待定点修饰片段中的最后一个核苷酸)。
[0011]所述上游同源臂序列和所述下游同源臂序列的长度可为100
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900bp，优选400
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500bp。
[0012]所述pAPN
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sgRNA
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1和所述pAPN
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sgRNA
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2均靶向pAPN基因上的两个不同的目标靶点，基因编辑蛋白对目标靶点进行酶切，再利用供体DNA实现序列重组，该系统在不改变pAPN蛋白其余氨基酸的情况下对编码猪pAPN蛋白第737位色基酸的密码子进行精确替换，将编码猪pAPN蛋白第737位色基酸的密码子替换为编码丙基酸的密码子。具体为：供体DNA在所述pAPN
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sgRNA
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1和所述pAPN
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sgRNA
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2的引导下，所述基因编辑蛋白对目标靶点进行酶切并引导供体DNA替换细胞中原有的同源片段，从而实现将编码猪pAPN蛋白第737位色基酸的密码子(TGG)突变为编码丙氨酸的密码子(GCC)，进而实现将猪pAPN蛋白第737位氨基酸由色氨酸到丙氨酸的精准突变。本专利技术提供的系统在精确修饰pAPN蛋白第737位氨基酸的同时，能够避免破坏或改变pAPN蛋白的其余氨基酸的正常表达，因此在抵抗TGEV感染的基础上，最大程度上保留pAPN蛋白生理活性功能，并且具有适用范围广、基因编辑效率高等优点，为制备、培育pAPN单氨基酸精确突变的抗TGEV猪新品种提供有力支撑。
[0013]在实际应用中，为了防止所述供体DNA被所述pAPN
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sgRNA
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1和/或所述pAPN
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sgRNA
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2识别、切割，可对所述供体DNA中的所述pAPN
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sgRNA
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1的靶序列和/或所述pAPN
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sgRNA
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2的靶序列上的一个或多个碱基进行同义突变。
[0014]进一步的，所述pAPN
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sgRNA
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1的靶序列如SEQ ID No.1所示。
[0015]所述pAPN
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sgRNA
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2的靶序列如SEQ ID No.2所示。
[0016]所述定点修饰片段的核苷酸序列如下：TCGAACCCCTCTTCCAACATTTCGAAACTCTCACTAAAAACGCCAC。
[0017]所述待定点修饰片段的核苷酸序列具体如下：TCGAACCCCTCTTCCAACATTTCGAAACTCTCACTAAAAACTGGAC。
[0018]更进一步的，所述供体DNA为SEQ ID No.3所示的双链DNA。
[0019]为了解决上述技术问题，本专利技术又提供了一种成套载体。
[0020]本专利技术提供的成套载体包括表达上述成套系统的载体。
[0021]进一步的，所述成套载体由表达上述基因编辑蛋白和上述pAPN
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.成套系统，所述成套系统包括基因编辑蛋白、pAPN
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sgRNA
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1、pAPN
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sgRNA
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2和供体DNA；所述pAPN
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sgRNA
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1和所述pAPN
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sgRNA
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2分别靶向pAPN基因的两个不同的靶序列，将所述pAPN
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sgRNA
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1的靶序列与所述pAPN
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sgRNA
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2的靶序列之间的片段记作待定点修饰片段；所述待定点修饰片段含有编码猪pAPN蛋白第737位色氨酸的密码子；所述供体DNA含有定点修饰片段，所述定点修饰片段为将所述待定点修饰片段中编码猪pAPN蛋白第737位色基酸密码子突变为丙氨酸的密码子后得到的片段。2.根据权利要求1所述的成套系统，其特征在于：所述基因编辑蛋白为Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2。3.根据权利要求1或2所述的成套系统，其特征在于：所述pAPN
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sgRNA
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1的靶序列如SEQ ID No.1所示；或，所述pAPN
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sgRNA
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2的靶序列如SEQ ID No.2所示；或，所述供体DNA依次包括上游同源臂序列、所述定点修饰片段和下游同源臂序列；所述上游同源臂序列为自所述待定点修饰片段中的第一个核苷酸对应的位点起向其上游方向延伸得到的任意一个DNA片段；所述下游同源臂为自所述待定点修饰片段中的最后一个核苷酸对应的位点起向其下游方向延伸得到的任意一个DNA片段；或，所述供体DNA为SEQ ID No.3所示的双链DNA。4.成套载体，所述成套载体包括表达权利要求1
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3任一所述成套系统的载体。5.根据权利要求4所述的成套载体，其特征在于：所述成套载体由表达权利要求1
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3中所述基因编辑蛋白和所述pAPN
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sgRNA
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1的载体、表达权利要求1
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3中所述基因编辑蛋白和所述pAPN
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sgRNA
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2的载体和含有权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：李奎，牟玉莲，黄雷，
申请(专利权)人：中农种源深圳科技有限公司，
类型：发明
国别省市：