一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN基因抗病和品质改良猪培育方法技术

本发明专利技术提供了一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN基因抗病和品质改良猪培育方法，属于动物育种技术领域。本发明专利技术通过基因编辑技术对猪CD163、pAPN和MSTN基因定点敲除，鉴于MSTN基因编辑后的引进商业猪种后代易出现后肢无力的畸形表型，将MSTN基因编辑引进商业猪种和MSTN基因编辑地方猪进行杂交，获得的MSTN基因编辑二元杂交猪突出廋肉型商品猪种和脂肪型地方猪种的品种特性，并保留MSTN基因编辑对猪种廋肉率和肉质改良的优势表型，将其与CD163和pAPN双基因编辑猪杂交，实现3个基因位点快速聚集。本发明专利技术成功育成抗蓝耳病、传染性胃肠炎、猪德尔塔冠状病毒病，并且瘦肉率高的优质猪新品系。品系。品系。

【技术实现步骤摘要】
一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN基因抗病和品质改良猪培育方法


[0001]本专利技术属于动物育种
，具体涉及一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN基因抗病和品质改良猪培育方法。

技术介绍

[0002]猪的生长速度和背膘厚度是当前养猪业的重要育种目标之一，具有重要的经济价值。但是猪的生长和背膘厚性状是由不同层级的多基因控制的复杂性状，是多个基因及其产物形成的调控网络的综合作用结果。因此很难通过传统育种技术和方法实现精确的育种选择。抗病力性状改良一直以来都是猪遗传育种研究的重点，然而由于这类性状度量困难，而且遗传力相对较低，常规手段改良进展速度较缓慢。因此，在培育抗病高产优质猪新品种的过程中，需要开发新的育种方法和采用协同选育策略。
[0003]我国是世界生猪养殖量和消费最大的国家，生猪养殖不仅是我国农业经济的重要组成部分，而且对国民生活具有重大的影响。目前生猪养殖行业面临的最大问题就是猪的传染性疾病，尤其是猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)、猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis ofswine，TGE)、猪德尔塔冠状病毒病(porcine deltacoronavirus disease，PDCoVD)等疾病，该疾病传染快、致死率高，严重影响了生猪养殖的健康发展。如何将这一严重损失降到最低，是目前迫切需要解决的一个科学问题。与此同时，培育瘦肉率高、肉质优良的生猪新品种也是猪经济性状改良的重要方向。培育抗病和品质等经济性状协同改良的新品种猪种是国家的重大需求，但是也是猪遗传育种领域的重点与难点。传统的动物育种方法受到种源的限制，其过程需要耗费大量的人力、物力和财力，经历漫长的培育过程。而且不同种间的杂交很困难，育种成果很难取得突破性进展。近年来出现的TALEN和CRISPR/Cas9等新型的基因组编辑工具，大大提高了基因组编辑的效率，无需携带外源筛选标记基因，较传统打靶技术具有更高的效率和安全性，为培育新品种猪种提供了快速高效的途径。
[0004]研究表明，CD163是仅在单核细胞/巨噬细胞细胞膜上存在的跨膜蛋白分子，是清道夫受体超家族成员。CD163蛋白不仅与内源性配体结合，调节炎症反应，还能作为细菌、病毒的受体，与外源性配体结合。CD163蛋白作为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染肺泡巨噬细胞的一种关键受体，能够促进PRRSV病毒脱衣壳以及将病毒基因组RNA释放到靶细胞胞浆中，而引起致病。
[0005]pAPN蛋白名为猪氨基肽酶N(Porcine aminopeptidase N，pAPN)，是猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的跨膜受体，属于Ⅱ型糖蛋白，它主要在仔猪小肠黏膜中表达量丰富，其表达量占分化肠细胞顶膜蛋白总量的8％，并且主要分布于仔猪空肠、回肠绒毛的刷状缘。pAPN蛋白在猪传染性胃肠炎病毒的感染过程中起关键作用，入侵的TGEV主要依赖于S蛋白受体结合域与pAPN蛋白的结合而最终导致猪传染性胃肠炎疾病的发生。猪德尔塔冠状病毒(porcine deltaconoravirus,PDCoV)感染猪只的临床症状与PEDV和TGEV感染后的症状类
似，也有认为PDCoV主要感染猪的小肠组织的原因可能是小肠上皮细胞上大量表达pAPN。
[0006]肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)可通过抑制MyoD基因家族成员的活性负向调控肌肉组织的生长，其表达量与肌群重量的改变呈负相关。MSTN基因作为一种肌肉生长的负性调控因子，其突变可引起肌细胞的增生和肥大，从而造成肌肉质量的增加。与此同时，MSTN基因编辑猪骨骼肌中多不饱和脂肪酸占骨骼肌总脂肪酸的比例增加，即脂肪酸不饱和度提高。因此，通过抑制MSTN蛋白活性培育出具有瘦肉率和猪肉品质均提高的生猪新品种，是猪分子育种领域内的前沿和热点，应用价值巨大，市场前景广阔。
[0007]尽管目标蛋白的功能已知，但培育多种优良性状聚集的新型猪品种存在较大的困难，现有技术也没有关于同时聚合优质高产、优质且抗猪蓝耳病、猪传染性胃肠炎和猪德尔塔冠状病毒病等疾病性状的猪新品种培育方法的报道。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN基因抗病和品质改良猪培育方法，使得到的基因编辑猪对PRRSV(猪蓝耳病毒)、TGEV以及PDcoV具有抗性，同时具有骨骼肌增多和肌内不饱和脂肪酸含量提高的表型，得到一种抗蓝耳病、抗传染性胃肠炎和猪德尔塔冠状病毒病及猪肉品质高的猪新品种。
[0009]本专利技术提供了一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN基因抗病和品质改良猪培育方法，包括以下步骤：
[0010]用基因编辑方法分别制备F0代MSTN基因编辑大白猪、F0代MSTN基因编辑梅山猪和F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪；
[0011]将所述F0代MSTN基因编辑大白猪为父本，以F0代MSTN基因编辑梅山猪为母本进行交配，得到F1代MSTN基因编辑大梅猪；
[0012]将所述F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪为父本，以所述F1代MSTN基因编辑大梅猪为母本进行交配，横交固定，得到同时敲除CD163、pAPN、MSTN的基因编辑猪。
[0013]优选的，所述F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪的制备方法包括采用CRISPR/Cas9技术制备CD163、pAPN双基因编辑大白猪细胞，利用体细胞克隆生产F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪。
[0014]优选的，所述CD163基因的特异性gRNA如SEQ ID NO:1所示。
[0015]优选的，所述pAPN基因的特异性gRNA如SEQ ID NO:2所示。
[0016]优选的，所述F0代MSTN基因编辑大白猪、F0代MSTN基因编辑梅山猪的制备方法为利用TALEN技术分别制备MSTN基因编辑大白猪和MSTN基因编辑梅山猪细胞，利用体细胞克隆生产F0代MSTN基因编辑大白猪和F0代MSTN基因编辑梅山猪。
[0017]优选的，所述MSTN基因的第三外显子特异性识别序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
[0018]优选的，所述横交固定后，对得到的F2代猪只进行CD163、pAPN和MSTN基因型检测；
[0019]所述检测的方法包括PCR扩增目标基因序列。
[0020]优选的，CD163基因型检测用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反向引物。
[0021]优选的，pAPN基因型检测用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的正向引物
和核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的反向引物。
[0022]优选的，MSTN基因型检测用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的正向引物和核苷酸序列如SE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN基因抗病和品质改良猪培育方法，其特征在于，包括以下步骤：用基因编辑方法分别制备F0代MSTN基因编辑大白猪、F0代MSTN基因编辑梅山猪和F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪；以所述F0代MSTN基因编辑大白猪为父本，以F0代MSTN基因编辑梅山猪为母本进行交配，得到F1代MSTN基因编辑大梅猪；将所述F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪为父本，以所述F1代MSTN基因编辑大梅猪为母本进行交配，横交固定，得到同时敲除CD163、pAPN、MSTN的基因编辑猪。2.根据权利要求1所述培育方法，其特征在于，所述F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪的制备方法包括采用CRISPR/Cas9技术制备CD163、pAPN双基因编辑大白猪细胞，利用体细胞克隆生产F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪。3.根据权利要求2所述培育方法，其特征在于，所述CD163基因的特异性gRNA如SEQ ID NO:1所示。4.根据权利要求2所述培育方法，其特征在于，所述pAPN基因的特异性gRNA如SEQ ID NO:2所示。5.根据权利要求1所述培育方法，其特征在于，所述F0代MSTN基因编...

【专利技术属性】
技术研发人员：李奎，牟玉莲，黄雷，
申请(专利权)人：中农种源深圳科技有限公司，
类型：发明
国别省市：