用于高效和特异性基因组编辑的构建体和其用途制造技术

本文公开的实施方案包括新型的核酸引导的核酸酶、新型的引导核酸和新型的可靶向的核酸酶系统，以及使用方法。在一些实施方案中，工程化的非天然存在的核酸引导的核酸酶可以与已知的引导核酸一起用于可靶向的核酸酶系统中。在某些实施方案中，可靶向的核酸酶系统可用于编辑人和其它物种的靶向基因组。在一些实施方案中，方法包括但不限于递归基因工程和可追踪基因工程方法。追踪基因工程方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于高效和特异性基因组编辑的构建体和其用途
[0001]交叉引用
[0002]本申请要求2020年9月18日提交的美国临时申请No.63/080,552和2021年5月6日提交的美国临时申请No.63/185,315的权益，这些申请以引用的方式并入本文中。

技术介绍

[0003]CRISPR是成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)的缩写。在回文重复序列中，核苷酸序列在两个方向上都是相同的。这些回文重复序列中的每一个之后都是短的间隔DNA区段。小的Cas(CRISPR相关系统)基因簇位于CRISPR序列旁边。CRISPR/Cas系统是一种原核免疫系统，可以赋予对外来遗传元件、例如质粒和噬菌体中存在的外来遗传元件的抗性，从而为原核生物提供一种形式的获得性免疫。含有间隔序列的RNA有助于Cas(CRISPR相关)蛋白识别和切割外源DNA。在大约50％的细菌基因组中发现了CRISPR序列，近90％的已测序古细菌选择了有效且稳健的代谢和调节网络，以防止不必要的代谢物生物合成并优化分配资源以最大限度地提高整体细胞适应性。这些网络的复杂性以及了解其结构和功能的途径有限以及重新编程细胞网络以修饰这些系统从而适应各种应用的能力使得该领域的进展复杂化。某些重新编程细胞网络的方法旨在修饰复杂通路的单个基因，但作为修饰单个基因的结果，可能会导致对这些基因或其它基因的不需要的修饰，从而妨碍识别实现所追寻的终点所需要的变化以及使修饰所寻求的终点复杂化。
[0004]CRISPR
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Cas驱动的基因组编辑和工程化总体上对生物学和生物技术产生了巨大影响。CRISPR
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Cas编辑系统需要多核苷酸引导的核酸酶、指导核酸酶切割基因组特定区域的引导多核苷酸(例如引导RNA(gRNA))以及可选的供体DNA盒，所述供体DNA盒可用于修复切割的dsDNA，从而在感兴趣的位点并入可编程的编辑。CRISPR
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Cas编辑的最早演示和应用使用Cas9核酸酶和相关gRNA。这些系统已被用于广泛物种的基因编辑，涵盖细菌到高级哺乳动物系统，如动物，在某些情况下用于人。然而，众所周知，关键的编辑参数，如原间隔序列相邻基序(protospacer adjacent motif，PAM)特异性、编辑效率和脱靶率等，取决于物种、基因座和核酸酶。人们越来越关注识别和快速表征可用于扩大和改进整体编辑能力的新颖核酸酶系统。
[0005]已知Cas12a是一种单一的RNA引导的CRISPR/Cas核酸内切酶，能够进行基因组编辑，与Cas9相比具有不同的特征。在某些实施方案中，基于Cas12a的系统允许将供体DNA快速可靠地引入基因组。此外，Cas12a拓宽了基因组编辑。CRISPR/Cas12a基因组编辑已在人细胞以及包括植物在内的其它生物体中进行了评估。与CRISPR/Cas9相比，CRISPR/Cas12a系统的几个特征有所不同。
[0006]已知Cas12a核酸酶识别富含T的原间隔序列相邻基序(PAM)序列(例如5'
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TTTN
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3'(AsCas12a、LbCas12a)和5'
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TTN
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3'(FnCas12a)；然而，针对SpCas9可比较的序列是NGG。Cas12a的PAM序列位于靶DNA序列的5'端，而对于Cas9，它位于3'端。此外，Cas12a能够使远离其PAM的DNA在原间隔序列的+18/+23位置周围裂解。这种裂解会产生交错的DNA突出端
(例如粘端)，而Cas9在两条链的原间隔序列的3'位置后靠近其PAM裂解并产生平端。在某些方法中，产生改变的核酸酶识别可以提供对Cas9或Cas12a的改进从而提高准确性。此外，Cas12a由单个crRNA引导，不需要tracrRNA，导致gRNA序列比Cas9使用的sgRNA更短。
[0007]还已知Cas12a显示出在crRNA加工中起作用的另外的核糖核酸酶活性。Cas12a用作不同物种的编辑工具(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))，与CRISPR/Cas9识别的PAM序列相比，允许使用替代的PAM序列。
[0008]众所周知的Cas12a蛋白
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RNA复合物识别富含T的PAM，并且裂解导致交错的DNA双链断裂。Cas12a型核酸酶与由crRNA的5'
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手柄形成的假结结构相互作用。由种子区域和3'端构成的引导RNA区段具有与靶DNA序列互补的结合序列。迄今为止表征的Cas12a型核酸酶已被证明可与单个gRNA一起使用并加工gRNA阵列。虽然已证实Cas12a型和Cas9核酸酶系统具有很高的影响力，但这两种系统都没有显示能够像预期的那样发挥可预测的作用，以实现设想的基因编辑技术全方位应用。
[0009]在目前的状态下，一系列努力试图对改进的CRISPR编辑系统进行工程化，以提高效率和准确性，其中包括对PAM特异性、稳定性和gRNA和/或核酸酶的序列进行工程化。例如，预期会增加gRNA稳定性的CRISPR/Cas9 gRNA的化学修饰被发现会导致人细胞中的插入缺失频率高出3.8倍。此外，其它研究包括Cas12a的结构引导诱变并进行筛选以识别具有更大范围的识别的PAM序列的变体。除了已建立的TTTV序列外，这些工程化的AsCas12a还识别TYCV和TATV PAM，并在体外和测试的人细胞中具有增强的活性。
[0010]CRISPR/Cas系统的一个版本，CRISPR/Cas9，已经过修饰以提供用于编辑靶向基因组的有用工具。通过将与合成引导RNA(gRNA)形成复合物的Cas9核酸酶递送到细胞中，可以在预定位置切割/编辑细胞的基因组，从而允许删除现有基因和/或添加新基因。这些系统很有用，但在靶向编辑的效率和准确性、不精确的编辑并发症以及用于商业相关情况(例如基因替换)时存在障碍方面存在一些重要限制。因此，需要改进的核酸引导的核酸酶系统，以提高的效率进行定向和准确的编辑。

技术实现思路

[0011]实施方案1提供了一种组合物，所述组合物包含(i)工程化的核酸引导的核酸酶，所述工程化的核酸引导的核酸酶包括包含与SEQ ID NO:143
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177和229中的任一者具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的工程化的核酸酶多肽，或编码与SEQ ID NO:143
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177和229中的任一者具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的一种多核苷酸或多种多核苷酸。实施方案2.实施方案1的组合物，所述组合物包括包含与SEQ ID NO:144、153和229中的任一者具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的工程化的核酸酶多肽，或编码与SEQ ID NO:144、153和229中的任一者具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的一种多核苷酸或多种多核苷酸。实施方案3.实施方案1或2的组合物，所述组合物包括包含与S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，所述组合物包含(i)工程化的核酸引导的核酸酶，所述工程化的核酸引导的核酸酶包括包含与SEQ ID NO:143
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177和229中的任一者具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的工程化的核酸酶多肽，或编码与SEQ ID NO:143
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177和229中的任一者具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的一种多核苷酸或多种多核苷酸。2.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包括包含与SEQ ID NO:144、153和229中的任一者具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的工程化的核酸酶多肽，或编码与SEQ ID NO:144、153和229中的任一者具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的一种多核苷酸或多种多核苷酸。3.如权利要求1或2所述的组合物，所述组合物包括包含与SEQ ID NO:144具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的工程化的核酸酶多肽或编码与SEQ ID NO:144具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的一种多核苷酸或多种多核苷酸。4.如任一前述权利要求所述的组合物，所述组合物包括包含与SEQ ID NO:153具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的工程化的核酸酶多肽或编码与SEQ ID NO:153具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的一种多核苷酸或多种多核苷酸。5.如任一前述权利要求所述的组合物，所述组合物包括包含与SEQ ID NO:229具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的工程化的核酸酶多肽或编码与SEQ ID NO:229具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的一种多核苷酸或多种多核苷酸。6.如任一前述权利要求所述的组合物，其中所述序列同一性为至少80％。7.如任一前述权利要求所述的组合物，其中所述序列同一性为至少95％。8.如任一前述权利要求所述的组合物，其中所述序列同一性为100％。9.如权利要求1所述的组合物，其中所述工程化的核酸酶多肽不含肽基序YLFQIYNKDF(SEQ ID NO.224)或编码不含肽基序YLFQIYNKDF(SEQ ID NO.224)的所述工程化的核酸酶多肽的一种多核苷酸或多种多核苷酸。10.如权利要求9所述的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:143
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151、161
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163、165、166、169、171
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175、177和229中的任一者具有至少60％序列同一性的氨基酸序列或编码与SEQ ID NO:143
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151、161
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163、165、166、169、171
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175、177和229中的任一者具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的一种多核苷酸或多种多核苷酸。11.如权利要求10所述的组合物，所述组合物包含与SEQ ID NO:149、151、175和177中的任一者具有至少60％序列同一性的氨基酸序列或编码与SEQ ID NO:149、151、175和177中的任一者具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的一种多核苷酸或多种多核苷酸。12.一种组合物，所述组合物包含可靶向的引导核酸引导的核酸酶复合物，所述核酸酶复合物包含任一前述权利要求的工程化的核酸引导的核酸酶并且还包含(ii)相容的引导核酸。13.如权利要求12所述的组合物，其中所述引导核酸是gRNA并且所述复合物是RNP。14.如权利要求12或13所述的组合物，其中所述引导核酸是分裂引导核酸。15.如权利要求13或14所述的组合物，其中所述gRNA是工程化的gRNA。16.如权利要求15所述的组合物，其中所述工程化的gRNA包含保守gRNA。17.如权利要求16所述的组合物，其中所述保守gRNA包含SEQ ID NO:291
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325中的任一
者，或其一部分。18.如权利要求17所述的组合物，其中所述保守gRNA包含SEQ ID NO:291
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325中的任一者的一部分。19.如权利要求18所述的组合物，其中所述部分是包含所述RNA的二级结构的核苷酸序列的高度保守部分。20.如权利要求18所述的组合物，其中所述二级结构包含假结。21.如权利要求13至20中任一项所述的组合物，其中所述gRNA是合成gRNA。22.如权利要求21所述的组合物，其中所述gRNA包含一种或多种化学修饰。23.一种在靶多核苷酸中的靶序列处或附近产生链断裂的方法，所述方法包括使所述靶序列与权利要求12
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22中任一项的可靶向的核酸引导的核酸酶复合物接触，其中所述复合物的所述相容的引导核酸靶向所述靶序列，并...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：工匠开发实验室公司，
类型：发明
国别省市：