Cas13蛋白、CRISPR-Cas系统及其应用技术方案

本发明专利技术涉及Cas13蛋白、CRISPR

【技术实现步骤摘要】
Cas13蛋白、CRISPR
‑
Cas系统及其应用


[0001]本专利技术涉及Cas13蛋白、CRISPR
‑
Cas系统及其应用，属于生物


技术介绍

[0002]CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统是细菌和古细菌为了防御入侵噬菌体的DNA而形成的。CRISPR系统包括2个家族，1类系统进一步分为I型、III型和IV型，2类系统分为II型、V型和VI型。这6种系统类型又细分为19种亚型。许多原核生物包含多个CRISPR
‑
Cas系统，这表明它们是兼容的并且可能共享组件。
[0003]CRISPR/Cas13系统是能够靶向RNA进行切割的CRISPR系统，该系统由Cas13蛋白和CRISPR RNA(向导RNA)组装形成一个由向导RNA引导的RNA靶向效应复合物。目前，Cas13家族共鉴定出四种亚型，包括Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas13d。
[0004]相对于RNAi技术和CRISPRi技术，CRISPR/Cas13系统能够实现更高的RNA降解，同时脱靶可能性更低。但是，目前已经发现的Cas13蛋白还存在如体积大、具有非特异性RNA酶活等的缺陷，这些缺陷会影响CRISPR/Cas13系统对靶RNA的编辑性能。不同微生物来源的CRISPR/Cas13系统显示出功能和结构上的多样性。因此，还需要继续挖掘更多Cas13蛋白以构建性能更优的CRISPR/Cas13系统。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术提供了一种Cas13蛋白，所述Cas13蛋白为如下(a)或(b)的蛋白质：
[0006](a)包含如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列的蛋白质；
[0007](b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且基本保留了其源自的序列的生物学功能的蛋白质。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述(a)为由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，(b)中，所述蛋白质的氨基酸序列与(a)相比，具有至少85％的序列同一性，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，(b)中，所述蛋白质的氨基酸序列与(a)相比，具有至少95％的序列同一性，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能。
[0011]本领域技术人员熟知，Cas13蛋白可以出现氨基酸变化，例如取代、缺失或添加，产生的Cas13蛋白能够保持其功能或活性。
[0012]所述的“取代”指在氨基酸序列中的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代；其中，“取代”可以是保守氨基酸取代。
[0013]“保守修饰”、“保守取代”或“保守置换”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。
[0014]本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见Watson等(1987),MolecularBiology ofthe Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。示例性保守取代于“示例性氨基酸保守取代”中陈述(见表1)。
[0015]表1示例性氨基酸保守取代
[0016]原始残基保守取代Ala(A)Gly(G)；Ser(S)Arg(R)Lys(K)；His(H)Asn(N)Gln(Q)；His(H)；Asp(D)Asp(D)Glu(E)；Asn(N)Cys(C)Ser(S)；Ala(A)；Val(V)Gln(Q)Asn(N)；Glu(E)Glu(E)Asp(D)；Gln(Q)Gly(G)Ala(A)His(H)Asn(N)；Gln(Q)Ile(I)Leu(L)；Val(V)Leu(L)Ile(I)；Val(V)Lys(K)Arg(R)；His(H)Met(M)Leu(L)；Ile(I)；Tyr(Y)Phe(F)Tyr(Y)；Met(M)；Leu(L)Pro(P)Ala(A)Ser(S)Thr(T)Thr(T)Ser(S)Trp(W)Tyr(Y)；Phe(F)Tyr(Y)Trp(W)；Phe(F)Val(V)Ile(I)；Leu(L)
[0017]本专利技术所提供的Cas13蛋白还包括其功能片段或衍生物，所述的衍生物在功能结构域(HEPN)或RXXXXH基序上具有与SEQ ID NO.1
‑
10中任一项所述的Cas13蛋白相同的序列。
[0018]本专利技术还提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含上述Cas13蛋白以及异源功能结构域。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述异源功能结构域包括脱氨酶(例如ADAR、APOBEC、AID或TAD)、报告蛋白(例如谷胱甘肽
‑
S
‑
转移酶、辣根过氧化物酶、氯霉素乙酰转移酶、β
‑
半乳糖苷酶、β
‑
葡糖醛酸糖苷酶或自发荧光蛋白)、检测标记、定位信号、蛋白质靶向域、DNA结合域(例如甲基化结合蛋白、LexADBD或Gal4 DBD)、表位标签(例如组氨酸标签、V5标签、FLAG标签、流感病毒血凝素标签、Myc标签、VSV
‑
G标签或硫氧还蛋白标签)、转录激活
功能域(例如VP64)、转录抑制功能域(例如KRAB或SID结构域)、核酸酶(例如FokⅠ)、甲基化活性酶、脱甲基酶、转录释放因子、RNA裂解多肽(例如具有单链RNA裂解活性的多肽、具有双链RNA裂解活性的多肽)、核酸连接酶、组蛋白修饰活性因子或核酸结合活性因子中的至少一种。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述异源功能结构域在所述Cas13蛋白的N端或C端进行融合，或者，所述异源功能结构域在所述Cas13蛋白的内部进行融合。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述定位信号是核定位信号(NLS)或核输出信号(NES)。
[0022]本专利技术还提供了一种CRISPR
‑
Cas系统，所述CRISPR
‑
Cas系统包含上述Cas13蛋白以及向导本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Cas13蛋白，其特征在于，所述Cas13蛋白为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)包含如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列的蛋白质；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且基本保留了其源自的序列的生物学功能的蛋白质。2.如权利要求1所述的Cas13蛋白，其特征在于，(b)中，所述蛋白质的氨基酸序列与(a)相比，具有至少85％的序列同一性，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能。3.如权利要求2所述的Cas13蛋白，其特征在于，(b)中，所述蛋白质的氨基酸序列与(a)相比，具有至少95％的序列同一性，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能。4.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含权利要求1～3任一项所述的Cas13蛋白以及异源功能结构域。5.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述异源功能结构域包括脱氨酶、报告蛋白、检测标记、定位信号、蛋白质靶向域、DNA结合域、表位标签、转录激活功能域、转录抑制功能域、核酸酶、甲基化活性酶、脱甲基酶、转录释放因子、RNA裂解多肽、核酸连接酶、组蛋白修饰活性因子或核酸结合活性因子中的至少一种。6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述异源功能结构域在所述Cas13蛋白的N端或C端进行融合，或者，所述异源功能结构域在所述Cas13蛋白的内部进行融合。7.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述定位信号是核定位信号或核输出信号。8.一种CRISPR
‑
Cas系统，其特征在于，所述CRISPR
‑
Cas系统包含权利要求1～3任一项所述的Cas13蛋白以及向导RNA，或者，所述CRISPR
‑
Cas系统包含权利要求4～7任一项所述的融合蛋白以及向导RNA；所述向导RNA能够与Cas13蛋白结合形成复合物并引导所述复合物与靶RNA接触。9.如权利要求8所述的CRISPR
‑
Cas系统，其特征在于，所述向导RNA包含间隔序列和同向重复序列；所述间隔序列的大小为15～60个核苷酸；所述同向重复序列的大小为15～40个核苷酸。10.如权利要求9所述的CRISPR
‑
Cas系统，其特征在于，所述间隔序列与靶RNA之间至少有15个核苷酸存在互补。11.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1～3任一项所述的Cas13蛋白，或者，所述多核苷酸编码权利要求4～7任一项所述的融合蛋白，或者，所述多核苷酸编码权利要求8～10任一项所述的CRISPR
‑
Cas系统。12.一种载体，其特征在于，所述载体携带权利要求11所述的多核苷酸。13.如权利要求12所述的载体，其特征在于，所述载体携带的多核苷酸连接调控元件。14.如权利要求13所述的载体，其特征在于，所述调控元件包括启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号、转座子、前导序列、多腺苷酸序列或标记基因中的至少一种。15.如权利要求12～14任一项所述的载体，其特征在于，所述载体包括病毒载体或非病毒载体中的至少一种。
16.如权利要求15所述的载体，其特征在于，所述病毒载体包括逆转录病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘苗病毒载体、杂合病毒载体、杆状病毒载体、单纯疱疹...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴宇轩，徐赛娟，王邱道，
申请(专利权)人：尧唐上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：