FOXD1在制备治疗和/或预防动物骨关节炎产品中的应用制造技术

本发明专利技术公开了FOXD1在制备治疗和/或预防动物骨关节炎产品中的应用。本发明专利技术发现，FOXD1具有如下功能：治疗和/或预防动物骨关节炎；治疗和/或预防动物前交叉韧带切断诱导的骨关节炎；延缓间充质干细胞的衰老；延缓间充质干细胞的复制性衰老。实验证明，在体外间充质干细胞中FOXD1的敲低加速了间充质干细胞的衰老，而FOXD1的过表达延缓了间充质干细胞的衰老；体内实验证实FOXD1基因可以降低关节软骨的退化和关节炎症反应，在骨关节炎疾病中具有很好的治疗效果。该发明专利技术为开发用于骨关节炎的基因治疗提供了新的思路，且扩大了临床基因治疗的可选择范围。

Application of FOXD1 in the treatment and / or prevention of animal osteoarthritis products

The invention discloses the application of FOXD1 in preparing products for treating and / or preventing animal osteoarthritis. FOXD1 has the following functions: treating and/or preventing osteoarthritis in animals; treating and/or preventing osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament amputation in animals; delaying the senescence of mesenchymal stem cells; and delaying the replicative senescence of mesenchymal stem cells. Experiments have shown that the knockdown of FOXD1 accelerates the senescence of mesenchymal stem cells in vitro, while the over-expression of FOXD1 delays the senescence of mesenchymal stem cells. In vivo experiments have shown that FOXD1 gene can reduce the degeneration of articular cartilage and arthritis, and has a good therapeutic effect in osteoarthritis diseases. The invention provides a new idea for the development of gene therapy for osteoarthritis, and enlarges the optional range of clinical gene therapy.

【技术实现步骤摘要】
FOXD1在制备治疗和/或预防动物骨关节炎产品中的应用
本专利技术涉及生物医学领域中，FOXD1在制备治疗和/或预防动物骨关节炎产品中的应用。
技术介绍
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是最常见的慢性退行性关节病损，临床表现为慢性关节疼痛，僵硬，肥大及活动受限。骨关节炎的发病与年龄，肥胖，炎症，创伤，遗传等多种因素有关。该病多发生于中老年人，且患病率随年龄而增加，此外女性发病率要高于男性。由于极高的患病率和致残率，及疾病所致的工作能力和生活能力的丧失，骨关节炎已然成为了危害人类健康，影响社会发展的主要疾病之一。目前，骨关节炎的治疗仍较多地采用药物疗法。与全身给药相比，关节腔给药可使药物直达部位，减少了其他途径的药物代谢，使得局部的药物浓度保持较高水平，起到良好的治疗作用，因而正迅速成为治疗骨关节炎的重要手段。但由于药物半衰期较短，需反复注射，增加了对关节部位的刺激和关节感染的风险。近年来，分子生物学和基因工程的发展为基因疗法在骨关节炎治疗方面的应用提供了可能性。利用基因疗法治疗骨关节炎就是将对骨关节炎有治疗作用的基因通过适当的载体导入关节腔中，使其在病变关节软骨细胞或滑膜细胞内长期、稳定、高效地表达从而起到治疗作用。在基因治疗中，携带目的基因到靶细胞内进行复制和表达的病毒载体有多种。常用的有逆转录病毒，慢病毒，腺相关病毒，单纯疱疹病毒等。逆转录病毒表达时间长，感染效率高，但只能感染分裂细胞。腺相关病毒表达时间长，安全性高，但也存在携带外源基因容量小，制备较困难的缺陷。单纯疱疹病毒携带外源基因容量大，但具有细胞毒性且不能长期表达。因此，合理地选择载体是基因治疗成功的关键之一。引发骨关节炎的最主要的因素是衰老。随着衰老，关节内的多种细胞如软骨细胞，滑膜细胞，间充质干细胞均发生细胞衰老和功能退化。因此，能够延缓或抵抗细胞衰老的基因可以为骨关节炎的治疗提供一种新的思路。2011年，科学家对来自101岁人类的细胞进行体外重新编程，将这些细胞的衰老相关表观遗传学修饰去除，使得这些细胞的代谢模式变得更符合年轻人的细胞。2016年，Cell文章报道细胞重编程可成功逆转早衰症小鼠的衰老。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供FOXD1在制备治疗和/或预防动物骨关节炎产品中的应用。本专利技术首先提供了FOXD1的下述任一应用：X1、制备治疗和/或预防动物骨关节炎的产品；X2、治疗和/或预防动物骨关节炎；X3、制备治疗和/或预防动物前交叉韧带切断诱导的骨关节炎的产品；X4、治疗和/或预防动物前交叉韧带切断诱导的骨关节炎；X5、制备延缓间充质干细胞的衰老的产品；X6、延缓间充质干细胞的衰老；X7、制备延缓间充质干细胞的复制性衰老的产品；X8、延缓间充质干细胞的复制性衰老。上述应用中，所述FOXD1可为如下A1)或A2)或A3)或A4)或A5)：A1)氨基酸序列为序列3的第11-474位的蛋白质；A2)在氨基酸序列为序列3的第11-474位的蛋白质的N端添加甲硫氨酸残基得到的蛋白质；A3)氨基酸序列为序列3的蛋白质；A4)在序列3的第11-474位或序列3的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A5)在A1)或A2)或A3)或A4)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。表：标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述A2)中的FOXD1，为与序列3的第11-474位或序列3所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。上述A2)中的FOXD1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)中的FOXD1的编码基因可通过将序列2的第4694-6088位或序列2的第4664-6088位的所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2的第4664-6088位所示的DNA分子编码序列3所示的蛋白质。本专利技术还提供了与所述FOXD1相关的生物材料的下述任一应用：X1、制备治疗和/或预防动物骨关节炎的产品；X2、治疗和/或预防动物骨关节炎；X3、制备治疗和/或预防动物前交叉韧带切断诱导的骨关节炎的产品；X4、治疗和/或预防动物前交叉韧带切断诱导的骨关节炎；X5、制备延缓间充质干细胞的衰老的产品；X6、延缓间充质干细胞的衰老；X7、制备延缓间充质干细胞的复制性衰老的产品；X8、延缓间充质干细胞的复制性衰老；所述生物材料可为下述B1)至B12)中的任一种：B1)编码所述FOXD1的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因细胞系；B11)降低所述FOXD1表达的核酸分子；B12)含有B11)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b1)-b4)中的任一种：b1)编码序列是序列表中序列1的第169-1563位或序列1的第166-1563位或序列2的第4664-6088位的cDNA分子或DNA分子；b2)序列表中序列1的第169-1563位或序列1的第166-1563位或序列2的第4664-6088位的cDNA分子或DNA分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述FOXD1的cDNA分子或DNA分子；b4)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述FOXD1的cDNA分子或DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码所述FOXD1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的所述FOXD1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述FOXD1且具有所述FOXD1功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码序列3的第11-474位或序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.FOXD1的下述任一应用：X1、制备治疗和/或预防动物骨关节炎的产品；X2、治疗和/或预防动物骨关节炎；X3、制备治疗和/或预防动物前交叉韧带切断诱导的骨关节炎的产品；X4、治疗和/或预防动物前交叉韧带切断诱导的骨关节炎；X5、制备延缓间充质干细胞的衰老的产品；X6、延缓间充质干细胞的衰老；X7、制备延缓间充质干细胞的复制性衰老的产品；X8、延缓间充质干细胞的复制性衰老。

【技术特征摘要】
1.FOXD1的下述任一应用：X1、制备治疗和/或预防动物骨关节炎的产品；X2、治疗和/或预防动物骨关节炎；X3、制备治疗和/或预防动物前交叉韧带切断诱导的骨关节炎的产品；X4、治疗和/或预防动物前交叉韧带切断诱导的骨关节炎；X5、制备延缓间充质干细胞的衰老的产品；X6、延缓间充质干细胞的衰老；X7、制备延缓间充质干细胞的复制性衰老的产品；X8、延缓间充质干细胞的复制性衰老。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述FOXD1为如下A1)或A2)或A3)或A4)或A5)：A1)氨基酸序列为序列3的第11-474位的蛋白质；A2)在氨基酸序列为序列3的第11-474位的蛋白质的N端添加甲硫氨酸残基得到的蛋白质；A3)氨基酸序列为序列3的蛋白质；A4)在序列3的第11-474位或序列3的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A5)在A1)或A2)或A3)或A4)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。3.与权利要求1或2中所述FOXD1相关的生物材料的下述任一应用：X1、制备治疗和/或预防动物骨关节炎的产品；X2、治疗和/或预防动物骨关节炎；X3、制备治疗和/或预防动物前交叉韧带切断诱导的骨关节炎的产品；X4、治疗和/或预防动物前交叉韧带切断诱导的骨关节炎；X5、制备延缓间充质干细胞的衰老的产品；X6、延缓间充质干细胞的衰老；X7、制备延缓间充质干细胞的复制性衰老的产品；X8、延缓间充质干细胞的复制性衰老；所述生物材料为下述B1)至B12)中的任一种：B1)编码权利要求1或2中所述FOXD1的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲静，刘光慧，付丽娜，任若通，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11