本发明专利技术涉及一种氨基糖苷类药物相关12s rRNA基因突变位点检测试剂盒，具体涉及氨基糖苷类药物相关12s rRNA基因多态性突变位点的检测引物组合物、试剂盒和方法，所述的引物组合物包括多态性检测引物与内控基因检测引物，其中，所述多态性检测引物的序列如下：多态性引物一：5′‑TACGCATTTA TATAGAGGATA‑3′；多态性引物二：5′‑TACGCATTTA TATAGAGGACG‑3′；多态性引物三：5′‑GTGCACTTGG ACGAACCAGA‑3′；多态性引物四：5′‑GCGTACACAC CGCCCGTCAAC‑3′；多态性引物五：5′‑GCGTACACAC CGCCCGTCAGT‑3′；多态性引物六：5′‑TAAATGCGTA GGGGTTTTAG‑3′；所述内控基因检测引物的序列如下：内控引物一：5’‑AGCAAGCAGG AGTATGACG‑3'；内控引物二：5'‑GAAAGGGTGT AACGCAACT‑3'。与现有技术相比，本发明专利技术在检测12s rRNA基因突变时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点。
【技术实现步骤摘要】
氨基糖苷类药物相关12srRNA基因突变位点检测试剂盒
本专利技术属于生物
，涉及一种氨基糖苷类药物相关12srRNA基因多态性突变位点的检测引物组合物、试剂盒和方法。
技术介绍
氨基糖苷类抗生素是临床上常用的抗生素，他们在分子结构、体内代谢、抗菌谱和毒副作用等多方面具有一些共同的特点。其主要副作用是氨基糖苷类抗生素可以致聋(AAID)。氨基糖苷类抗生素损害第8对脑神经、前庭和耳蜗的细胞造成耳聋。AAID患者可分为两类，一类因接受了毒性剂量的氨基糖苷类抗生素而致聋，这类病人多无遗传背景。另一类接受了常规剂量或单次剂量的氨基糖苷类抗生素而致聋，这类病人有遗传家族史。1993年，首次发现AAID患者与线粒体12SrRNA基因第1555位A→G均质性点突变有关，该突变使原有的Alw26I酶切位点消失而易于被检出。线粒体DNA基因12SrRNA的A1555G突变是AAID的主要易感因素，C1494T突变和961insC可强化A1555G突变造成的AAID风险。A1555G和C1494T点突变的检出为临床医生预测个体氨基糖苷类抗生素遗传易感性提供了一个可能性，A1555G和C1494T点突变阳性个体本人及其母系亲属应避免接触氨基糖苷类抗生素。但是，目前缺乏快速有效检测线粒体12SrRNA基因的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种氨基糖苷类药物相关12srRNA基因多态性突变位点的检测引物组合物、试剂盒和方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术的目的之一在于提出一种氨基糖苷类药物相关12srRNA基因多态性检测引物组合物，其包括多态性检测引物与内控基因检测引物，其中，所述多态性检测引物的序列如下：多态性引物一：5′-TACGCATTTATATAGAGGATA-3′；多态性引物二：5′-TACGCATTTATATAGAGGACG-3′；多态性引物三：5′-GTGCACTTGGACGAACCAGA-3′；多态性引物四：5′-GCGTACACACCGCCCGTCAAC-3′；多态性引物五：5′-GCGTACACACCGCCCGTCAGT-3′；多态性引物六：5′-TAAATGCGTAGGGGTTTTAG-3′；所述内控基因检测引物的序列如下：内控引物一：5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3'；内控引物二：5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'。本专利技术的目的之二在于提出一种氨基糖苷类药物相关12srRNA基因多态性检测试剂盒，包括分别采用试管盛装的多态性检测引物与内控基因检测引物，其中，所述多态性检测引物的序列如下：多态性引物一：5′-TACGCATTTATATAGAGGATA-3′；多态性引物二：5′-TACGCATTTATATAGAGGACG-3′；多态性引物三：5′-GTGCACTTGGACGAACCAGA-3′；多态性引物四：5′-GCGTACACACCGCCCGTCAAC-3′；多态性引物五：5′-GCGTACACACCGCCCGTCAGT-3′；多态性引物六：5′-TAAATGCGTAGGGGTTTTAG-3′；所述内控基因检测引物的序列如下：内控引物一：5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3'；内控引物二：5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'。在本专利技术的一种优选的实施方式中，所述的试剂盒中还包括有分别采用试管盛装的蒸馏水、PCR反应预混液、阳性质控12srRNA基因A1555G突变质粒、阳性质控12srRNA基因A1555G野生质粒、阳性质控12srRNA基因C1494T突变质粒和阳性质控12srRNA基因C1494T野生质粒。在本专利技术的一种更优选的实施方式中，所述的阳性质控12srRNA基因A1555G突变质粒通过以下方法获得：采用PCR技术，获取12srRNA基因A1555G位点的突变型片段，然后，将突变型片段与pEASY-BluntCloningKit载体连接，转化，再转入大肠杆菌感受态细胞培养，最后，提取质粒，即得到。在本专利技术的一种更优选的实施方式中，所述的阳性质控12srRNA基因A1555G野生质粒通过以下方法提取得到：采用PCR技术，获取12srRNA基因A1555G位点的野生型片段，然后，将野生型片段与pEASY-BluntCloningKit载体连接，转化，再转入大肠杆菌感受态细胞培养，最后，提取质粒，即得到。在本专利技术的一种更优选的实施方式中，所述的阳性质控12srRNA基因C1494T突变质粒通过以下方法提取得到：采用PCR技术，获取12srRNA基因C1494T位点的突变型片段，然后，将突变型片段与pEASY-BluntCloningKit载体连接，转化，再转入大肠杆菌感受态细胞培养，最后，提取质粒，即得到。在本专利技术的一种更优选的实施方式中，所述的阳性质控12srRNA基因C1494T野生质粒通过以下方法提取得到：采用PCR技术，获取12srRNA基因C1494T位点的野生型片段，然后，将野生型片段与pEASY-BluntCloningKit载体连接，转化，再转入大肠杆菌感受态细胞培养，最后，提取质粒，即得到。在本专利技术的一种更优选的实施方式中，所述的试剂盒采用挡板分隔为两个独立腔体，每个腔体中安装有海绵，在海绵上还加工有用于放置试管的容器孔，所述试剂盒的两个腔体中，其中一个腔体中放置装有蒸馏水与PCR反应预混液的试管，另一个腔体中放置装有各阳性质控质粒、多态性检测引物和内控基因检测引物的试管。在本专利技术的一种更优选的实施方式中，所述的容器孔在试剂盒内平行排列布置。本专利技术的目的之三在于提出一种检测氨基糖苷类药物相关基因12srRNA基因突变位点的方法，具体包括以下步骤：(1)样本处理和核酸提取：利用商品化的DNA提取试剂盒处理样本，所提取DNA保证其OD260/OD280的值应在1.8～2.0，浓度应在5～50ng/μL之间，样本DNA质量不合格者不得用于检测，建议低于5ng/μL者重新进行核酸提取，高于50ng/μL者予以适当稀释至规定的浓度范围，提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存，保存时间不要超过6个月。此外，各质控品使用前室温融化，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒待用。(2)PCR反应体系构建：提前30分钟将各试剂取出，室温融化，涡旋振荡10s，2000rpm离心15秒待用，然后，将PCR反应预混液、对应引物和水混合均匀后配制得到对应检测位点的反应混合液，然后将其置于PCR反应管中；(3)然后将已处理样本、阳性质控品和阴性质控品加入PCR反应管中，盖紧管盖(避免气泡产生)，离心后将管壁上液体全部甩至管底，然后立即进行PCR扩增反应。(4)设置PCR扩增反应程序，其依次分为预变性、变性和退火、信号采集三个阶段，其中，预变性阶段的温度设置为95℃，处理时间为15min，循环次数为1次，变性阶段为在95℃下处理10s，退火、信号采集阶段则在60℃下保持30s，且变性与信号采集阶段循环40次。(5)利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过SYBRGreen染料和扩增产物的杂交，检测反应体系的SYBR荧光强度来判定检测结果。SYBR为检测信号，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种氨基糖苷类药物相关12s rRNA基因多态性检测引物组合物，其特征在于，其包括多态性检测引物与内控基因检测引物，其中，所述多态性检测引物的序列如下：多态性引物一：5′‑TACGCATTTA TATAGAGGATA‑3′；多态性引物二：5′‑TACGCATTTA TATAGAGGACG‑3′；多态性引物三：5′‑GTGCACTTGG ACGAACCAGA‑3′；多态性引物四：5′‑GCGTACACAC CGCCCGTCAAC‑3′；多态性引物五：5′‑GCGTACACAC CGCCCGTCAGT‑3′；多态性引物六：5′‑TAAATGCGTA GGGGTTTTAG‑3′；所述内控基因检测引物的序列如下：内控引物一：5’‑AGCAAGCAGG AGTATGACG‑3'；内控引物二：5'‑GAAAGGGTGT AACGCAACT‑3'。
【技术特征摘要】
1.一种氨基糖苷类药物相关12srRNA基因多态性检测引物组合物，其特征在于，其包括多态性检测引物与内控基因检测引物，其中，所述多态性检测引物的序列如下：多态性引物一：5′-TACGCATTTATATAGAGGATA-3′；多态性引物二：5′-TACGCATTTATATAGAGGACG-3′；多态性引物三：5′-GTGCACTTGGACGAACCAGA-3′；多态性引物四：5′-GCGTACACACCGCCCGTCAAC-3′；多态性引物五：5′-GCGTACACACCGCCCGTCAGT-3′；多态性引物六：5′-TAAATGCGTAGGGGTTTTAG-3′；所述内控基因检测引物的序列如下：内控引物一：5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3'；内控引物二：5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'。2.一种氨基糖苷类药物相关12srRNA基因多态性检测试剂盒，其特征在于，包括分别采用试管盛装的多态性检测引物与内控基因检测引物，其中，所述多态性检测引物的序列如下：多态性引物一：5′-TACGCATTTATATAGAGGATA-3′；多态性引物二：5′-TACGCATTTATATAGAGGACG-3′；多态性引物三：5′-GTGCACTTGGACGAACCAGA-3′；多态性引物四：5′-GCGTACACACCGCCCGTCAAC-3′；多态性引物五：5′-GCGTACACACCGCCCGTCAGT-3′；多态性引物六：5′-TAAATGCGTAGGGGTTTTAG-3′；所述内控基因检测引物的序列如下：内控引物一：5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3'；内控引物二：5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'。3.根据权利要求2所述的一种氨基糖苷类药物相关12srRNA基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括有分别采用试管盛装的蒸馏水、PCR反应预混液、阳性质控12srRNA基因A1555G突变质粒、阳性质控12srRNA基因A1555G野生质粒、阳性质控12srRNA基因C1494T突变质粒和阳性质控12srRNA基因C1494T野生质粒。4.根据权利要求3所述的一种氨基糖苷类药物相关12srRN...
【专利技术属性】
技术研发人员：田晓丽，
申请(专利权)人：宁波美丽人生医药生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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